产有机酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及产芽孢条件优化

■杨继业 郭晓军 郭 威 吕纪涛 袁洪水 朱宝成

（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071000）

我国农作物秸秆资源丰富，年产量高达6.4亿吨[1]，它们主要用作饲料、肥料、工业原料等[2]。目前，玉米秸秆青贮技术在我国北方地区得到广泛的应用和推广[3]。青贮主要是利用秸秆表面的乳酸菌在厌氧的条件下，将秸秆饲料中的可溶性糖类物质降解成乳酸、乙酸等，降低青贮饲料pH值，抑制青贮饲料中腐败微生物的活动，从而保持秸秆中的营养成分，同时可以增加饲料适口度、提高消化率[4-5]。近年来，国内外对于乳酸菌青贮添加剂做了大量的研究，研究表明，添加乳酸菌制剂可以提高饲料中乳酸、乙酸的水平，降低氨态氮和总氮的比值，促进多糖和粗纤维的转化，从而改善青贮饲料的发酵品质[6-8]。但是乳酸菌是一类不形成芽孢的细菌，因此工业化生产不宜保存和运输[9]。而芽孢具有极强的抗逆性，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等[10]，因此在工业生产中可以保证微生物菌剂的活性，提高其产品质量[11]。因此有必要进一步研究筛选具有产酸能力的芽孢菌，对突破乳酸菌的使用“瓶颈”具有重要意义，并对筛选的菌株进行产芽孢条件优化，以期提高青贮发酵的效果，优化生产工艺，降低生产成本，为后续的工业生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

河北农业大学生命科学学院制药工程实验室保藏的200株芽孢杆菌。

1.1.2 培养基

NA、NB培养基参照程丽娟等(2000)的方法[12]配制，筛选培养基、种子培养基、发酵培养基参照刘敏等(2008)的方法[13]配制。

产芽孢优化培养基参照许净净等(2013)的方法[14]配制。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的筛选

1.2.1.1 溴甲酚紫平板的制作

筛选培养基经121℃高压蒸汽灭菌15 min后，在超净台中，将溴甲酚紫溶液按1.6%～3.0%的比例，经0.20 μm的无菌滤头加入。待温度下降到40～50℃时倒入无菌平板中，待凝固即可。

1.2.1.2 初筛

从供试菌株斜面挑取少量菌在溴甲酚紫平板上划“十”字，于37℃培养24 h，筛选能够使平板变黄的菌株。

1.2.1.3 复筛

将初筛所得菌株接种于装有50 ml种子培养基，37℃、200 r/min摇床培养12 h制成种子液。按6%的接种量接种于100 ml发酵培养基中，于37℃、200 r/min摇床培养48 h。发酵液于4℃、5 000 r/min离心10 min，通过平板扩散法筛选溴甲酚紫平板中黄色溶解圈较大的菌株。

1.2.2 产物鉴定

将通过平板扩散法筛选到的产有机酸最高的菌株发酵液送到中国农业大学农业部饲料效价与安全监督检验测试中心，进行有机酸含量的测定。

1.2.3 菌株的鉴定

1.2.3.1 菌落及菌体形态观察

在NA平板上对菌株菌落形态进行观察，并对菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，显微镜观察菌体形态。

1.2.3.2 菌株生理生化特性

菌株生理生化特征参照《伯杰细菌鉴定手册》[15]和《常见细菌系统鉴定手册》[16]进行。

1.2.3.3 菌株DNA的提取和16S rDNA序列扩增与分析

细菌DNA的提取和PCR扩增参照张永辉等（2011）的方法[17]，将PCR扩增产物送北京宝锐通生物技术有限公司进行测序，将所得序列与GenBank数据库中序列进行Blast分析比对，并构建系统发育树。

1.2.4 菌株产芽孢条件优化

1.2.4.1 菌株种子培养

将斜面培养目的菌接种于50 ml种子培养基的250 ml容量的三角瓶中，于37℃、200 r/min摇床培养12 h后使用。

1.2.4.2 菌株发酵培养

将种子液按6%的接种量于50 ml发酵培养基的250 ml容量的三角瓶中，于37℃、200 r/min摇床培养48 h，取样观察芽孢形成率情况。

1.2.4.3 单因素试验

通过改变培养基的碳源、氮源、无机盐确定对芽孢产量影响显著的培养基成分[14]。

1.2.4.4 培养基的优化

按正交试验表L9（34）设计4因素3水平试验，根据单因素试验确定的最适碳源、氮源、无机盐对培养基的组成进行条件优化。然后在确定最适培养基的基础上，对培养基的发酵时间、接种量、pH值、装液量进行发酵条件优化[14]。

1.2.4.5 测定方法

芽孢染色参照沈萍等（1999）方法[18]，并测定芽孢形成率；采用平板菌落计数法测定活菌总数。

2 结果

2.1 菌株筛选

2.1.1 初筛试验结果

筛选出能够使培养基变黄的菌株共13株，列举菌株R42-16、R42-14、R42-10、J51-8如图1所示 。

图1 初筛结果

2.1.2 复筛试验结果

对初筛所得的菌株进行摇瓶发酵培养，其发酵液经离心注入筛选培养基的孔中，如图2所示，菌株R42-16周围具有明显的黄色溶解圈，因此本试验选取菌株R42-16作为后续研究菌株。

图2 复筛结果

2.2 产物鉴定结果（见图3及表1）

对菌株R42-16发酵液中的乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸进行液相色谱分析。由图3及表1可以看出，菌株代谢产生的有机酸主要为乳酸和乙酸，分别达到174、221 μg/ml。研究表明，大量的乳酸和乙酸可以降低青贮饲料pH值，抑制其他有害微生物的生长，减少物质损失[5]。

表1 有机酸含量（μg/ml）

2.3 菌株鉴定

2.3.1 形态学鉴定（见图4）

由图4可知，菌株R42-16在NA培养基上生长24 h后，菌落呈乳白色，不透明，圆形，表面十字凸起，干燥，有皱褶。

图3 乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸（从左到右）液相色谱图

图4 R42-16菌株的菌落（左）、菌体（中）、芽孢（右）形态

菌体形态呈杆状，菌体长约1.7 μm，宽约0.7 μm，革兰氏染色呈阳性，有芽孢，芽孢呈椭圆形，长约1.0 μm，宽约0.7 μm。

2.3.2 菌株生理生化试验

对菌株R42-16生理生化鉴定试验，结果见表2。

表2 生理生化鉴定

根据菌株的形态鉴定和生理生化试验结果，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus）。

2.3.3 菌株分子学鉴定

在NCBI网站上，将得到R42-16菌株的16S rDNA序列与标准菌株进行同源性比对，并构建系统发育树见图5。

结合菌株的形态特征和生理生化试验结果以及16S rDNA分子鉴定结果，将R42-16菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.4 R42-16菌株产芽孢条件优化

2.4.1 碳源对R42-16菌株芽孢产量的影响（见表3）由表3可知，以蔗糖为碳源的芽孢产量最高，玉米粉次之，但考虑经济效益方面，选择玉米粉作为培养基的最佳碳源，其芽孢形成率为24.37%，活菌总数达3.56×109cfu/ml。

2.4.2 氮源对R42-16菌株芽孢产量的影响（见表4）

图5 R42-16菌株16S rDNA系统发育树

表3 不同碳源对芽孢产量的影响

表4 不同氮源对芽孢产量的影响

当以酵母浸粉作为氮源时,芽孢形成率达66.99%，活菌总数达1.68×109cfu/ml，芽孢产量达到1.12×109cfu/ml，因此选择酵母浸粉作为培养基的最佳氮源。2.4.3 无机盐对R42-16菌株芽孢产量的影响(见表5)

表5 无机盐对芽孢产量的影响

无机盐不仅对于菌体的生长具有很大影响，而且对芽孢的产生也有很大作用。研究表明，Mn2+是菌体生长和芽孢生成的微量元素，是许多酶的辅助因子，如超氧化物歧化酶、黄嘌呤氧化酶等[11]。由表5可知，当以Mn2+作为无机盐时，该菌株产芽孢能力最强，其中芽孢产量达1.11×109cfu/ml,芽孢形成率和活菌总数分别为52.55%、2.11×109cfu/ml。其次是CaCl2·H2O，Ca2+的加入可以促进菌株生成芽孢，其中芽孢形成率达到71.81%，因此选择MnSO4·H2O、CaCl2·H2O作为培养基的最佳无机盐。

2.4.4 培养基组成正交优化试验结果

根据单因素试验结果配制不同浓度的培养基,按正交试验表L9(34)设计4因素3水平试验，摇床培养48 h，测定芽孢形成率、活菌总数及芽孢产量，试验结果见表6。结果表明，对芽孢产量影响的主次因素为：酵母浸粉＞CaCl2·H2O＞玉米粉＞MnSO4·H2O。试验中最佳组合为A1B1C1D1，其中芽孢产量达到1.46×109cfu/ml，但正交优化表中最优组合为A1B2C1D1，因此需要做验证试验（试验结果见表7）。

表6 培养基组成正交试验结果

表7 验证试验

由表7可知，组合A1B1C1D1芽孢形成率为81.12%，活菌总数为1.77×109cfu/ml，而组合A1B2C1D1，芽孢形成率为82.74%，活菌总数为1.90×109cfu/ml，因此，组合A1B2C1D1的芽孢产量略高，即最优培养基为玉米粉1%、酵母浸粉2%、MnSO4·H2O 0.01%、CaCl2·H2O 0.01%。

2.4.5 培养条件正交优化的试验结果

对培养基发酵时间、接种量、pH值、装液量按正交试验表L9(34)设计4因素3水平试验，试验结果见表8。由结果可知，对芽孢产量影响的主次因素为：装液量＞pH值＞发酵时间＞接种量。试验组中最佳组合为A1B1C1D1，其芽孢形成率为92.87%，活菌总数为3.29×109cfu/ml。但正交优化表中最优组合为A2B1C1D1，因此需要做验证试验（试验结果见表9）。

由表9可知，组合A1B1C1D1，芽孢形成率为92.09%，活菌总数为3.22×109cfu/ml，而组合A2B1C1D1，芽孢形成率为93.76%，活菌总数为3.19×109cfu/ml，组合A1B1C1D1的活菌总数略高，而组合A2B1C1D1的芽孢产量略高，通过比较芽孢产量，组合A2B1C1D1较高，达 2.99×109cfu/ml，因此组合 A2B1C1D1为最佳组合，即发酵时间48 h、接种量4 ml、pH值 6、装液量50 ml/250 ml。

3 讨论

3.1 菌株的筛选鉴定

近年来，对玉米秸秆中添加青贮剂做了大量研究。其中有机酸的含量和种类可以反映青贮品质，其中乳酸、乙酸和丁酸是评价的重点，乳酸和乙酸可以使青贮初期pH值下降，抑制其他腐败菌对蛋白质的分解，增加青贮饲料的适口性，故越多越好，而丁酸在发酵过程中会产生腐臭味，故越少越好[19-21]。

表8 培养条件正交优化试验结果

表9 验证试验

目前大量研究表明，添加乳酸菌可以提高青贮饲料的发酵品质，但对于乳酸菌的研究机理目前很少，一些研究主要集中在发酵产物乳酸和乙酸上[22]。Danner等(2003)[23]曾提出有机酸对于青贮饲料的有氧稳定性的影响，其中乙酸＞乳酸，在青贮过程中乙酸是一种可以抑制微生物生长的因子，能够抑制饲料中霉菌的生长[24]。但乳酸菌不产芽孢，对工业生产就会有一定的限制。而本试验筛选获得的R42-16经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），可代谢产生乳酸、乙酸等有机酸，其中乙酸的含量高达221 μg/ml，其次是乳酸，达174 μg/ml，其中丁酸所占比例也比较小，仅8 μg/ml。张建梅等（2012）[25]筛选的产酸芽孢菌株GF1为蜡样芽孢杆菌，在发酵10 h时乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量达到最高，分别为143、473、26、24 μg/ml，但12 h时就开始呈下降趋势，而菌株R42-16在48 h时产酸量仍很高，而且丁酸的含量比菌株GF1低。刘敏等（2008）[13]筛选的产酸芽孢菌株L-1为枯草芽孢杆菌，产乳酸、乙酸的量分别为255.11、59.28 μg/ml，虽然乳酸的含量略高，但乙酸含量较少。因此本试验菌株在产酸能力上具有一定的优越性。

另外，解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，也是益生菌的一种。范会兰等（2009）[26]研究表明：解淀粉芽孢杆菌对犊牛腹泻病原菌大肠杆菌有抑制作用。因此用菌株R42-16发酵后的青贮秸秆饲喂反刍动物后还可能起到防治腹泻的功能，以待进一步研究。

3.2 菌株产芽孢条件优化

芽孢是抗逆性休眠体，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等[10]，在工业生产中较高的生物量和芽孢产率有利于产品的加工、贮藏，可以保证产品的质量[27]。因此，有必要对优化菌株的芽孢形成条件做一研究，在试验过程中以芽孢产量作为参考指标，能够保证菌剂在青贮过程中迅速繁殖。

本试验通过对发酵培养基组成和发酵条件的优化，在试验过程中，甘露醇、蔗糖、玉米粉为碳源时，其芽孢产量相差不多，但考虑到经济问题，选用玉米粉作为碳源；酵母浸粉作为氮源时，其芽孢形成率、活菌总数均最高，报道中很少见，这可能与微生物不同有关；对于无机盐的筛选，其中Mn2+对菌株R42-16发酵生产中芽孢产量影响最大，可能和它是许多酶的活化剂有关，这与吴逸飞等（2013）[9]研究结果一致。Ca2+的加入可以促进菌株生成芽孢，这与郝庆红等（2013）[27]研究结果一致。而Fe2+、Cu2+对菌体的生长具有抑制作用，Fe2+能够与一些蛋白酶络合，会直接抑制蛋白质分解活性，Cu2+在-CN过量时，可以与4个-CN络合，进而影响酶的稳定性。有研究表明，对发酵培养基突然静置或添加固体介质可以提高芽孢形成率[28]，因此我们将在工业化生产中进一步深入研究，以期完善其生产工艺，提高经济效益。

4 结论

本试验获得一株产有机酸的芽孢杆菌，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

通过正交试验得到菌株R42-16产芽孢最佳培养基组成为：玉米粉1%、酵母浸粉2%、MnSO4·H2O 0.01%、CaCl2·H2O 0.01%。最佳培养条件为：发酵时间 48 h、接种量4 ml、pH值 6、装液量 50 ml/250 ml。此条件下芽孢形成率为93.76%、活菌总数为3.19×109cfu/ml、芽孢产量达2.99×109cfu/ml，达到了菌株芽孢优化的预期效果。本试验芽孢优化所得参数，可为菌株R42-16大规模的生产提供参考。