骨形态生成蛋白-15基因和生长分化因子-9基因mRNA在雄性小鼠各组织中表达的研究

□ 杨 骅

转化生长因子-β(TGF-β)是细胞内信号蛋白的最大家族，在不同物种中，目前已发现TGF-β超家族转化生长因子有40多种，而BMP15和GDF9均为上述家族成员之一。1993年Lee与同事共同确定了TGF-β家族中的新成员GDF9基因，并发现其在卵巢中高表达，而Mcgrath等在1995年进一步证实GDF9基因在卵母细胞中高表达。Otsuka首次报道了BMP15基因在小鼠垂体组织中有表达，并揭示了在垂体组织中BMP15基因通过自分泌调控作用有选择地促进卵泡刺激素的合成。

近年来，研究人员发现在一些物种睾丸组织中也有GDF9、BMP15基因的转录，提示这些生长因子会不会在调节雄性生殖功能方面也有着潜在作用。Peter G.Stanton则于2009年首次研究证明了在大鼠精子发生过程中 GDF9、BMP15基因在转录和翻译水平的表达与定位，并且得出在体外GDF9蛋白可以抑制支持细胞紧密连接的功能和促进抑制素B的产生。本文选择小鼠作为研究对象，原因是国内尚未有关于小鼠BMP15、GDF9基因在一个生精周期睾丸各时间点mRNA转录水平变化的报道。

一、材料和方法

(一)实验动物及标本采集。选用清洁级出生后3、9、15、21、28、35、56天雄性ICR小鼠以及雌性性成熟ICR小鼠，由南京医科大学动物医学中心提供，购于北京维通利华南京分公司。颈椎脱臼处死ICR雄性小鼠，“V”字形切口剪开皮肤，暴露胸腔、腹腔等，取出心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、垂体、下丘脑九种组织。雌性性成熟ICR小鼠取卵巢组织，步骤同上。

(二)仪器及试剂。MJ PTC-200型PCR扩增仪(美国MJ公司);ABI7300荧光定量 PCR仪(美国 ABI公司);EP5604稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);DYCP-31D水平电泳槽(北京六一仪器厂);FR-200紫外凝胶成像分析系统(上海医用分析仪器厂)。提取组织总RNA的试剂:Trizol(Invitrogen，USA);DEPC(BioSharp，USA);氯仿、异丙醇(上海实验试剂有限公司，中国)。总RNA反转录成cDNA试剂:dNTP、逆转录酶、逆转录酶缓冲液、RNA酶抑制剂(Fermentas，USA)。PCR 检测试剂:dNTP、Mg2+、buffer、TaqM(申能博彩，中国)。荧光定量PCR检测试剂:SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)。

(三)PCR引物设计。根据GenBank中小鼠的BMP15和GDF9 cDNA序列，利用计算机软件DNAstar，依照cDNA设计原则，序列如下:

BMP15:5’GAGCGAAAATGGTGAGGCTG3’，5’GGCGAAGACACTCCGTC3’，分子量 214bp。GDF9:5’GCTCTATAAGACGTATGCTACC3’，5’CAGAGTGTATAGCAAGACCGAT 3’，分子量342bp。

(四)PCR反应参数。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸45℃，循环35次，72℃延伸10分钟。

(五)RT-PCR反应参数。50℃2分钟;95℃10分钟;95℃15秒，63℃1分钟，40个循环;95℃1分钟，60℃30秒，95℃15秒。

二、结果

图1 成年雄性小鼠各组织中BMP15基因的转录

(一)BMP15、GDF9基因转录的组织特异性。取成年雄性ICR小鼠，提取心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、垂体、下丘脑九种组织的RNA，并逆转录为 cDNA，用 PCR技术分析各组织中BMP15、GDF9基因的转录情况，其中卵巢组织为阳参。结果显示:BMP15基因在小鼠睾丸组织中有转录，此外在附睾和垂体中也有少量转录。GDF9基因仅在睾丸组织中有转录，其它组织中均未见转录。

图2 成年雄性小鼠各组织中GDF9基因的转录

图3 不同时期雄性小鼠睾丸中BMP15基因的转录水平

(二)睾丸BMP15、GDF9基因在睾丸不同发育时期转录水平比较。选取出生后3、9、15、21、28、35天以及性成熟(8周以上)的雄性ICR小鼠睾丸，提取总RNA，逆转录生成cDNA。使用real time PCR的方法，以GAPDH基因作为内参，对模板中BMP15、GDF9基因的原始拷贝数进行半定量，以探明小鼠出生后一个生精周期睾丸各时间点BMP15、GDF9基因转录水平的变化情况。结果显示:出生后3天，睾丸组织中就有着极低水平BMP15基因的转录，但随着睾丸的发育，转录水平有了一定程度的升高，但升高程度不显著。GDF9基因在出生后3天，睾丸组织中同样有着极低水平的转录，但伴随着睾丸的发育，转录水平有了很大程度的升高，在28天达到峰值，并在此后保持稳定。

图4 不同时期雄性小鼠睾丸中GDF9基因的转录水平

三、讨论

研究发现BMP15、GDF9基因并不仅在女性卵巢中有表达，在某些物种的睾丸和垂体中也有BMP15和GDF9 mRNA的存在，提示这些因子在调节睾丸和垂体的功能方面有着潜在作用。本实验以性成熟雄性ICR小鼠作为研究对象，使用PCR的方法，发现BMP15基因在小鼠睾丸、附睾和垂体组织中均有转录，而GDF9基因仅在睾丸组织中有转录。使用real time PCR的方法，探讨了BMP15、GDF9基因在睾丸中的转录水平随着个体发育，尤其在出生后一个生精周期中的变化情况，其中GDF9基因转录水平持续上升，在出生后28天达到高峰并持续稳定表达，这一变化趋势与之前Peter G.Stanton在大鼠中的报道情况比较吻合。今后还将利用原位杂交的方法对小鼠精子发生过程中GDF9、BMP15基因在转录水平的定位做进一步的研究。

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