不同消毒方法对变形链球菌在牙本质片上黏附的影响

苗 燕 王宏峰 郝玉庆.郑州市口腔医院牙体牙髓科，河南郑州 45005；.四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川成都 6004

不同消毒方法对变形链球菌在牙本质片上黏附的影响

苗 燕1王宏峰1郝玉庆2
1.郑州市口腔医院牙体牙髓科，河南郑州 450052；2.四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川成都 610041

目的比较3种消毒方法对变形链球菌（S.mutans）在人牙本质片上黏附的影响，为牙体标本消毒提供参考。方法制备人牙本质片60个，随机均分为3组，每组20个，采用不同的方法消毒。第1组：高压蒸汽灭菌30 min；第2组：10%福尔马林溶液浸泡1周；第3组：3%过氧乙酸溶液浸泡1周。将不同消毒方法的牙本质片与S.mutans进行体外黏附实验，采用扫描电子显微镜（SEM）观察牙本质片表面形态变化及S.mutans黏附量多少，并采用菌落形成单位计数法（CFU）计数S.mutans在不同消毒方法的牙本质表面的黏附量，用SPSS 13.0软件对实验结果进行统计学分析。 结果 不同消毒方法的牙本质片在电子显微镜下表面形态无明显变化，SEM显示S.mutans在三组牙本质片上黏附变化比较，差异无统计学意义（F=3.21，P＞0.05），CFU显示S.mutans培养后3组黏附差异无统计学意义（F=3.29，P＞0.05）。结论3种消毒方法对体外研究细菌黏附于牙本质片影响甚微，目前高压蒸汽灭菌法简单、可靠、易于操作，应作为消毒方法的首选。

变形链球菌；黏附；消毒；牙本质片

龋病是发生于牙体硬组织，多因素影响下以细菌感染为主的慢性感染性疾病，龋病的始动因子是细菌在牙面黏附、定植，分泌酸性物质导致无机物脱矿及有机物崩解[1]。变形链球菌（Streptococci mutans，S.mutans）是致龋菌中的优势菌，与龋病的关系最为密切[2]。在口腔医学科研及实验教学等模拟口腔的体外黏附实验中，常利用S.mutans与人或牛的离体牙及羟基磷灰石片等来研究细菌黏附力的大小。在仿生模拟操作中，离体牙的形态、质地及解剖形态是其他模拟材料所无法替代的[3]。但实验中的离体牙来源于口腔，自身带有大量的病原微生物，因此在实验前对其消毒就很有必要[4]。因为这不仅可以保障实验结果的真实可信稳定可靠，而且对于操作者的安全也至关重要。但目前普遍的医学工作者及临床实习学生对离体牙消毒知识知之甚少[5]。目前离体牙的消毒主要是高压蒸汽灭菌法、福尔马林、戊二醛及过氧乙酸等化学液体消毒法等，但牙片的不同消毒方法对细菌的黏附有无影响目前报道较少。本实验主要通过对S.mutans在不同消毒方法的牙本质片上黏附能力进行研究，以期为牙体标本消毒提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验菌株、培养基及设备

S.mutans ATCC25175（血清型C），由口腔疾病研究国家重点实验室（四川大学）提供。脑心浸液（BHI）培养基（Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，England）；比浊仪（Becton Dickinson and Company，USA）；扫描电镜（SEM）（Hitachi S-2460 N，Tokyo，Japan）；Melag-24型高压蒸汽灭菌器（Melag，德国）；10%福尔马林消毒液（湖北兴银河化工有限公司）；3%过氧乙酸（源乐，江西键宝医药科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 人牙本质片的制备、分组及消毒 收集四川大学华西口腔医院2008年3～4月因正畸需要而拔除的上颌第一前磨牙，取牙体完整无龋坏且根尖孔完全闭合的30颗牙齿，去尽牙齿表面的血污及牙周软组织，生理盐水反复冲洗后自然晾干。操作者戴医用橡胶手套用慢速手机在持续喷水的状态下于釉牙骨质界处截断牙根，保留牙冠。将牙冠包埋并固定于其特制的底座中，在精密切削机上用特制的金钢砂片在注水的条件下以500 r/min的低速削去牙冠釉质层，再按牙体长轴方向将近表层的牙本质切削成5 mm×5 mm×0.5 mm的牙本质薄片，选取60片形态较好，切面平整的牙本质片随机分成3组，每组20片，分别采用不同的方法进行消毒。第1组：采用高压蒸汽灭菌法，121℃灭菌，时间为30 min；第2组：10%福尔马林溶液浸泡1周；第3组：3%过氧乙酸溶液浸泡1周。第2组和第3组消毒后的离体牙用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）反复荡洗去除残留消毒液4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌悬液准备 复苏S.mutans菌株，接种于BHI血琼脂平板上，37℃，80%N2、10%CO2、10%H2培养S.mutans 24 h，涂片镜检为纯培养后，再接种于液体BHI液体培养基，生长时间同上，经形态学和生化试验鉴定为纯培养物，收集菌细胞，用BHI液体培养基调节菌液浓度为1×108cfu/mL备用。

1.2.3 细菌黏附实验 将3组不同消毒方法的牙本质片各20个分别置于1 mL预先配制的菌液中，并加入8 mL的BHI培养基，37℃上述环境培养S.mutans 1 h后，每组分别取出10个，用无菌PBS液清洗牙本质片表面非附着菌块，然后进行扫描电子显微镜标本制作。3组各剩下的10个牙本质用无菌PBS液清洗非附着细菌后置于5 mL生理盐水的塑料离心管中，在超声水浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）中以100 r/min振荡2 min，洗涤液进行10倍系列稀释为1×104cfu/mL后用微量取样枪选择能准确计数的最佳稀释度样液10 μL滴于BHI血琼脂平板表面，均匀涂布开后厌氧培养24 h进行菌落形成单位计数，每个牙本质片涂布3个平板，取其平均值为菌落形成单位计数，并根据稀释倍数换算成单位面积牙本质片上的菌落形成单位。

1.2.4 扫描电镜标本制作 牙本质片室温干燥，2.5%戊二醛固定2 h，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每个梯度脱水10 min，液态CO临界点干燥，镀金，SEM下观察S.mutans在牙本质片上的黏附差异。

1.3 统计学方法

用SPSS 13.0统计软件包对实验结果进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙本质表面形态和细菌黏附情况

SEM观察见三组牙本质表面平整，形态清晰无破坏，牙本质小管直径相近。在牙本质表面或牙本质小管内壁黏附有S.mutans。见图1。3种不同消毒方法的牙本质片扫描电镜下随机各选取10块10 μm×10 μm面积进行统计学分析显示，结果显示三组S.mutans黏附量比较差异无统计学意义（F=3.21，P＞0.05）。见表1。

2.2 三组细菌在牙本质片上黏附后培养定量测定

结果显示：S.mutans在3种不同消毒方法的牙本质片上黏附差异无统计学意义 （F=3.29，P＞0.05）。见表1。

3 讨论

S.mutans是目前公认的口腔致龋菌，致龋机制主要是通过其菌毛表面分布的大量大分子类物质，如葡萄糖基转移酶（GTF）、脂磷壁酸（LTA）、表面蛋白等，黏附定植于牙面形成牙菌斑，在牙菌斑内发挥致龋作用，使牙齿脱矿，形成龋损。除非通过口腔卫生措施将黏附的牙菌斑彻底清除，否则它将长期聚集于牙面并导致龋病和（或）牙周疾病。因此S.mutans在龋病的发生发展过程中起着至关重要的作用[6]，所以本实验选择S.mutans作为实验用菌。

目前在模拟口腔的黏附实验中，常用的底物多选择羟基磷灰石和离体牙，虽然羟基磷灰石粉或片形态均一，易于消毒，但在质地、形态及仿生效果方面均不及离体牙。但离体牙来源于临床患者口腔，拔除过程中常带有大量的病原微生物，研究表明在离体牙的牙髓，根管及根尖可能存在大量的血源性病原体如：人类免疫缺陷病毒（HIV），乙肝病毒（HBV），丙肝病毒（HCV）及一些细菌性病原体[7]，在离体牙收集及将其磨切成牙本质片的操作过程中，往往是在无冷却液的环境下进行，因此病原微生物可通过受损的黏膜皮肤或以水汽雾的形式等污染操作者，因此只有对离体牙进行有效的消毒才能及时去除感染源，切断传播途径，才能保证操作者的安全[8-9]。牙片消毒的方法很多，最常用的是高压蒸汽灭菌法，其他还有化学热力灭菌，微波辐射灭菌[10-11]，液体消毒有2%碱性戊二醛溶液、3%过氧化氢溶液、过氧乙酸溶液、5.25%次氯酸钠溶液，醋及煮沸消毒法，气体消毒有环氧乙烷等，但牙片经不同消毒方法处理后S.mutans在上面的黏附有无差异目前鲜有报道。

在本实验中采用常见的3种消毒方法：高压蒸汽灭菌法、福尔马林溶液及过氧乙酸溶液对牙本质片进行不同浓度不同时间的消毒，然后通过S.mutans体外黏附实验观察细菌在牙本质片上黏附变化。实验结果显示黏附牙片无论在扫描电镜下观察还是菌落计数法3种消毒方法的牙本质片上黏附的S.mutans差异无统计学意义（P＞0.05）。在本实验中影响细菌黏附差异主要存在于两方面：细菌自身因素和消毒后的牙本质表面特性。相同的S.mutans黏附量就取决于消毒后的牙本质组成成分、硬度及表面粗糙度等[12]。为了最大限度地降低实验误差，在本实验中所有的牙本质片都是经笔者亲自磨切及抛光，所以黏附差异就决定于消毒后的牙本质成分及硬度的变化。实验结果显示细菌黏附量没有明显变化说明不同消毒方法对牙本质成分及硬度的影响变化不明显。

消毒是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。灭菌是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，只有有效的消毒才能切断疾病感染源和传播途。在离体牙灭菌常采用的化学药物消毒方法中，甲醛是一种无色有毒气体，福尔马林是甲醛在室温下的水溶液，研究发现离体牙浸泡于10%的福尔马林溶液7 d可有效达到灭菌的目的[13]，虽然福尔马林是一种有效的灭菌剂，但同时它也具有细胞毒性和遗传毒性，操作不慎可引起皮肤和眼睛的灼伤和腐蚀，经鼻腔吸入后可刺激上呼吸道，被国际癌症研究机构认作是一种潜在的致癌物。长期接触可引起鼻咽癌和髓系白血病发病概率的增加，因此实验需要在通风橱内进行，但这既不安全也不方便实验的操作[14-15]。过氧乙酸溶液系广谱、速效、高效灭菌剂，本品是一种强的氧化剂，可以杀灭一切微生物，对病毒、细菌、真菌及芽孢均能迅速杀灭，可广泛应用于各种器具及环境消毒。0.2%溶液接触物体10 min基本可达到灭菌目的。Hope等[9]发现离体牙浸泡于Gigasept PA（活性成分：过氧乙酸）中7 d可完全灭菌，是一种安全有效可替代福尔马林作为离体牙消毒的方法，但Gigasept PA主要用于医疗器械的消毒，不易获得。Tijare等[4]认为醋作为家庭用品，容易得到，易于操作，也可达到消毒离体牙的目的，也可取代福尔马林用于离体牙的消毒。但其他的消毒液如次氯酸钠、过氧化氢、戊二醛等都不能达到百分百灭菌的效果。环氧乙烷低温灭菌常实用于贵重、精密、怕热怕湿物品的灭菌[16]，但研究发现[17-18]如果单纯依赖环氧乙烷消毒离体牙，无论在30℃或60℃都可以检测到孢子的存在，所以在消毒之前必须采用其他办法消除牙齿上来自于血液中的病原菌。过量接触环氧乙烷会引起溶血、过敏反应、细胞突变等，离体牙上残留的环氧乙烷会对实验操作者具有很大的危害。γ辐射消毒离体牙无高温高压，无气体及化学物质的加入，消毒后对牙齿的纳米力学性能方面没有影响，但能否达到彻底杀灭病原微生物还有待进一步研究。

采用溶液浸泡消毒，对溶液的浓度及浸泡时间都要有严格的要求，本实验采用的溶液浓度低，浸泡时间短，不影响实验观察效果，但若过长时间的浸泡就有可能会引起牙齿理化性质的改变，况且浸泡消毒后牙本质片上残留的消毒液去除也比较麻烦，如果去除不彻底就会杀灭实验用菌，对细菌的黏附结果产生影响。高压蒸汽灭菌是目前认为最为有效可靠、安全且易于操作的灭菌方法，这需要121℃，至少15 min就可达到灭菌目的，无论是实验研究或是临床离体牙消毒操作都易于进行，应为首选，值得推广[19]。但对于银汞充填的牙齿应避免高压蒸汽灭菌，因为在高压排气时汞蒸汽可释放于空气中，而引起污染，另外要避免体外实验中离体牙反复的高压蒸汽消毒，因为这可能影响牙齿的机械性能，导致牙齿变脆而易折断[20]。

在体外大量模拟口腔的相关实验中，如何选择一种安全方便易于操作而又不影响离体牙自身特性的消毒方法，还需要我们做进一步深入的研究。

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Influence of different sterilization on adhension of streptococci mutans to dentin slices

MIAO Yan1WANG Hongfeng1HAO Yuqing2
1.Department of Operative and Endodontics,Zhengzhou Stomatological Hospital,He'nan Province,Zhengzhou 450052, China;2.State Key Laboratory of Oral Diseases,Sichuan University,Sichuan Province,Chengdu 610041,China

ObjectiveTo compare the influence of 3 different sterilization methods on adherence of S.mutans to dentin slices.Methods 60 dentin slices were randomly divided into three groups with 20 specimens in each group,they were given 3 different sterilization methods.The first group of detin slices was disinfected by autoclaving for 30 min;the second group was immersed in 10%formalin solution for 1 week;and the third group was immersed in 3%peracetic acid for 1 week.The quantification of attached S.mutans on the surfaces of different dentin was assayed by means of scanning electron microscope (SEM)and clone forming unit (CFU)method in vitro.Results There was no obvious change in morphology among the three groups of dentin slices under the electron microscope.The quantification of attached S.mutans was no statistically significant difference among the three groups under SEM(F=3.21,P＞0.05),and there was no statistically significant difference from CFU after bacterial culturer(F=3.29,P＞0.05).Conclusion Little effect is observed in the test of bacterial adhesion to dentin slices of different sterilization methods.So far,autoclaving is seen as the simple and reliable sterilization method.

S.mutans;Adhesion;Disinfect;Dentin slices

R187

A

1673-7210（2015）03（c）-0114-04

2014-12-15本文编辑：苏 畅）

苗燕（1977.2-），女，河南内乡人，硕士研究生；研究方向：龋病病因及其防治。