维生素D受体TaqⅠ、ApaⅠ基因多态性与昆明汉族2型糖尿病肾病的相关性研究

韩 睿 董 霞 苏炳驰 杨薇 刘 华 宋滇平.昆明医学院第一附属医院糖尿病科，云南昆明 65003；.昆明医学院第一附属医院检验科，云南昆明 65003

维生素D受体TaqⅠ、ApaⅠ基因多态性与昆明汉族2型糖尿病肾病的相关性研究

韩 睿1董 霞1苏炳驰1杨薇1刘 华2宋滇平1
1.昆明医学院第一附属医院糖尿病科，云南昆明 650032；2.昆明医学院第一附属医院检验科，云南昆明 650032

目的研究云南昆明地区汉族2型糖尿病患者维生素D受体基因TaqⅠ（rs731236）、ApaⅠ（rs7975232）与2型糖尿病肾病（DN）发病的相关性。 方法运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，对昆明汉族108例DN及180例糖尿病不伴肾病（NDN）患者的维生素D受体（VDR）基因TaqⅠ、ApaⅠ基因多态性进行检测，分析并比较其临床资料、基因型频率、等位基因频率等。结果NDN患者TaqⅠ位点的基因型频率分别为T/T 88.89%、T/t+t/t 11.11%,等位基因频率分别为T 93.33%、t 6.67%，DN患者TaqⅠ位点的基因型频率分别为T/T 94.44%、T/t+t/t 5.6%，等位基因频率分别为T 97.22%、t 2.78%；NDN患者ApaⅠ位点的基因型频率分别为a/a 45.60%、A/A+A/a 54.40%，等位基因频率分别为A 32.22%、a 67.78%，DN患者ApaⅠ位点的基因型频率分别a/a 51.85%、A/A+A/a 48.15%，等位基因频率分别为A 25.00%、a 75.00%。两组患者ApaⅠ、TaqⅠ位点的基因型频率及等位基因频率比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05）。②ApaⅠ位点的aa和Aa基因型是DN发生的危险因素（OR=6.313、5.525，P=0.018、0.034）。 结论aa和Aa基因型是DN发生的危险因素。

2型糖尿病；维生素D受体；基因多态性；糖尿病肾病

流行病学资料表明，约40%的糖尿病患者发生糖 尿病肾病（DN）[1]，而且DN的发生与血糖水平无关。Zhang等[2]研究表明，维生素D受体（VDR）基因敲除的糖尿病小鼠更易发展为严重的蛋白尿和肾小球硬化，提示VDR基因与DN的发生有关。本研究探讨发生DN的危险因素及其易感基因，并从分子角度探讨TaqⅠ、ApaⅠ位点多态性与DN的关系，为进一步探索DN的危险因子和筛查易感基因提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择昆明医学院第一附属医院 （以下简称 “我院”）2010年11月～2012年8月住院治疗的2型糖尿病（T2DM）患者288例，男150例，女138例；年龄22～75岁，平均（52.94±11.94）岁。所有对象均无血缘关系，无其他自身免疫性疾病病史。该研究经我院伦理委员会通过，患者知情同意并签署知情同意书。T2DM诊断参照1999年WHO诊断标准。参考美国糖尿病协会推荐的DN诊断标准：随机尿白蛋白肌酐比值（albumin creatinine ratio，ACR）≥30 μg/mg即诊断为DN，随机尿ACR＜30 μg/mg为糖尿病不伴肾病（NDN）。排除DN合并发热、尿路感染、尿路结石、急慢性肾炎、肾病综合征、恶性肿瘤以及伴有大血管病变等病史者。且所有患者均给予口服降糖药或接受胰岛素治疗，近3个月内未接受叶酸、维生素B12治疗。

1.2 研究指标

采用问卷调查，包括人口学资料、个人疾病史、心脑血管疾病史等，采用标准、规范的方法测量研究对象的坐位血压、身高、体重、腰围、臀围，并计算体重指数（BMI）、腰臀比（WHR）。两组患者取空腹及餐后2 h静脉血，测定血糖、血脂、胰岛素、糖化血红蛋白等。以上测定在日本奥林巴斯AU5400型全自动生化分析仪、FT-630G仪器上进行，由专人负责，并进行质量控制。

建立了校内实习基地，依托教学基地，加强将专业理论知识转化为解决工作实际问题的能力，可以熟悉制造业、商业企业等工艺操作实际过程，弥补会计基础和财务管理课程理论课表达中的不足，让学生通过真实情景和过程提前进入工作环境。

1.3.1 DNA提取 采集研究对象清晨空腹肘部静脉血2 mL，用全血DNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）提取血液基因组DNA，应用Eppendorf AG分光光度计（德国）进行DNA纯度/浓度测定后，置于-80℃保存备用。

[3]Vandevyver C，Wylin T，Cassiman JJ，et al.Influence of the vitamin D receptor gene alleles on bone mineral density in postmenopausal and osteoporotic women [J].J Bone Miner Res，1997，12（2）：241-247.

2.3 DN相关危险因素的Logistic回归分析

1.3.4 ApaⅠ位点、TaqⅠ位点核苷酸直接测序 为验证酶切结果，笔者将PCR产物进行直接测序（送北京百泰克生物技术有限公司检测），酶切结果与直接测序结果一致，见图1、2。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，均检验其正态性，若为正态分布且方差齐则采用t检验，若不为正态分布，则采用秩和检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。相关性分析采用Logistic多元回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.6 基因突变分析 对144例入选患者进行基因突变检测，共检测到33种突变基因，DNMT3A和IKZF1突变在CD56+组中分别为0例和6例(75.00%)，而在CD56-组分别为11例(100.00%)和2例(25.00%)，差异有统计学意义(χ2=4.442、4.781；P=0.035、0.029；P<0.05)；除去以上2种突变基因，其他31种突变基因在CD56+组和CD56-组组间的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表6。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较

两组在年龄、BMI、WHR、血糖、血脂、胰岛素抵抗指数方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。DN组糖尿病病程显著长于NDN组，SBP高于NDN组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

两组患者ApaⅠ、TaqⅠ基因型以及等位基因频率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 两组患者ApaⅠ、TaqⅠ基因型以及等位基因频率比较

采用仪器自带镉标准溶液对电化学法进行准确性检定，测得峰电位为-785mV，镉含量为0.327mg/kg，符合仪器预设范围。

1.3.3 酶切鉴定基因型 PCR扩增产物分别用ApaⅠ、TaqⅠ限制性核酸内切酶（由MBI Fermentas公司提供）酶切后，置于2%的琼脂糖凝胶电泳确定基因型。结果示：ApaⅠ位点中纯合子AA基因型740 bp；纯合子aa基因型520 bp和220 bp；杂合子Aa基因型740 bp、520 bp、220 bp。TaqⅠ位点中纯合子TT基因型454 bp；杂合子Tt基因型454 bp、293 bp、161 bp；纯合子tt基因型293 bp、161 bp。

以是否并发DN作为因变量，余指标为自变量行Logistic回归分析。结果提示SBP和ApaⅠ位点的aa、Aa基因型是发生DN的危险因素。见表3。

3 讨论

近年来发现DN的发生与维生素D的缺乏有关。在DN患者中，维生素D不足的发生率高达77.5%[5]。而维生素D是通过VDR来发挥其生物活性。故VDR基因的差异有可能是导致DN的主要原因之一，故DN的发生与VDR基因遗传多态性有关。迄今为止，已发现VDR存在多种单核苷酸多态性（SNPs），且每种突变的发生频率在人群中存在一定的地域、种族差异[6]。与糖尿病相关的SNPs主要集中在FokⅠ（rs2228570）、BsmⅠ（rs1544410）、ApaⅠ（rs797 5232）、TaqⅠ（rs731236）这4种基因。对于VDR基因四个常见变异位点而言，国内外均有研究表明，外显子起始密码子的突变位点（FokⅠ）等位基因频率在病例组与对照组之间的差异有统计学意义，F等位基因是DN的易感基因[7-8]，而BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位点的基因型和等位基因型的差异一直存在争议[9-10]。另有研究显示[11]，在DN和NDN患者中，VDR基因在TaqⅠ外显子9的等位基因中差异显著，TaqⅠ基因及其功能多态性与DN的发病有关。高水平的1，25（OH）2D3能改善DN的进展，但这种联系能被FokⅠ多态性改变[12]。本研究发现，DN组和NDN组患者ApaⅠ位点及TaqⅠ位点的等位基因和基因型频率比较差异均无统计学意义（P＞0.05），但进一步的回归分析显示，ApaⅠ位点的aa和Aa基因型可能是发生DN的危险因素。其可能原因为ApaⅠ位点在VDR基因第9内含子上，其突变影响VDR mRNA的稳定性，从而影响血管紧张素系统的活性，参与DN的发生。但还需进一步验证。故进一步研究VDR基因多态性与DN的关系对探索该基因与DN可能的发病机制具有重要意义。

首先，理想一致于信念。理想信念是具备中国特色的一个固定用法，我们绝对不能单独强调其中之一，或者以偏概全。理想是面向未来，信念直指现在。共产党员的追求，既是对未来的追求，也是对现实的追求。理想是信念的前提，信念是理想的基础。就当前来说，共产主义理想是中国特色社会主义信念的前提，中国特色社会主义信念是共产主义理想的基础。坚持二者的统一性，不仅可以培养中共党员实现共产主义理想的热情和积极性，而且可以使他们坚定中国特色社会主义信念，促使他们在工作中勤奋踏实，自觉提高自身本领，稳步迈向共产主义。

[2]Zhang Z，Sun L，Wang Y，et al.Renoprotective role of the vitamin D receptor in diabetic nephropathy[J].Kidney Int，2008，73（2）：163-171.

1.3.2 PCR扩增 扩增所使用的引物：①ApaⅠ位点[3]：上游引物5＇-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3＇，下游引物5＇-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3＇。②TaqⅠ位点[4]：上游引物5＇-CAGAGCATGGACAGG GAG-3＇，下游引物5＇-AGGAGAGGCAGCGGTACTG-3＇。PCR扩增条件：①ApaⅠ位点：共35个循环：94℃预变性3 min，然后94℃变性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，反应完成后，72℃再延伸6 min。②TaqⅠ位点：共35个循环：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。反应完成后，72℃再延伸5 min。取PCR扩增产物进行2%琼脂糖泳后，以50 bp DNA Ladder Marker作为分子量参照物，用紫外凝胶成像系统拍照（ApaⅠ位点PCR产物片段长度为740 bp，TaqⅠ位点PCR产物目的片段长度为454 bp）。

众所周知，农村经济合作组织是独立的法人实体，因此，在发展过程中应该具有独立的法人资格。在此种情况下，我国农业部门要想让农村经济合作组织发挥出应有的作用，就需要提高农村经济合作组织的社会地位，让其能够与银行组织、政府部门等其他组织进行有效合作，从而有效缩小生产经营风险，提高劳动生产率，潜移默化中推动我国农业实现可持续发展，提高农民的经济收入。

1.3 研究方法

[1]刘志红.糖尿病肾病的遗传背景研究[J].中华内科杂志，2002，41（8）：561-562.

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将PBL教学法引入高等师范院校水文学教学中，以问题为基础，以学生为主体，以教师为导向的启发式教育，以培养学生的能力为教学目标，发挥问题对学习过程的指导作用，调动学生的主动性和积极性．PBL教学模式的应用可以让学生在一个真实的情境中对驱动问题展开探究，从而解决问题，并在探究过程中学习及应用学科思想．同时，学生要创制出一套能解决问题的可行产品，这样也可以锻炼彼此之间的团队协作能力，作为课堂学习的成果公开展示答辩，在展示答辩过程中培养学生的发问习惯，提升学生的讲解思辨能力．PBL教学法作为一种有效提升学生综合素质能力，提升学生学习兴趣的教学模式可以在高等院校水文学教学中推广．

秦铁崖听乔十二郎介绍自己是他表姐夫的好朋友，既感到滑稽，也感到温暖，随即对老太医说：“不用客气，饮茶清谈，也很不错。”

[6]Van Belle TL，Gysemans C，Mathieu C.Vitamin D and diabetes：the odd couple[J].Trends Endocrinol Metab，2013，24（11）：561-568.

[7]常永丽.维生素D受体FokⅠ基因多态性与内蒙古地区蒙汉人群糖尿病肾病的相关性研究[J].医学综述，2012，18（8）：1243-1245.

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采用SPSS 19.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

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Association between TaqⅠ ,ApaⅠ of Vitamin D receptorgene polymorphism and type 2 diabetic nephropathy of the Han Nationality in Kunming

HAN Rui1DONG Xia1SU Bingchi1YANG Wei1LIU Hua2SONG Dianping1
1.Department of Diabetes,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Yunnan Province,Kunming 650032,China;2.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Yunnan Province,Kunming 650032,China

ObjectiveTo investigate the relationship between TaqⅠ(rs731236),ApaⅠ(rs7975232)and type 2 diabetic nephropathy of the Han Nationality in Yunnan area of Kunming.Methods PCR-RFLP technique was used to detected TaqⅠ,ApaⅠof Vitamin D receptor gene polymorphism in 108 patients with diabetic nephropathy and 180 patients without nephropathy.The clinical data,genotype frequencies,allele frequencies were analyzed and compared. Results①Genotype frequency of TaqⅠ loci in NDN patients were T/T 88.89%and T/t+t/t 11.11%,allele frequency were T 93.33%and t 6.67%,respectively,genotype frequency of TaqⅠloci in DN patients were T/T 94.44%and T/t+ t/t 5.6%,allele frequency were T 97.22%and t 2.78%,respectively;genotype frequency of ApaⅠ loci in NDN patients were a/a 45.60%,A/A+A/a 54.40%,allele frequency were A 32.22%and a 67.78%,respectively,,genotype frequency of ApaⅠloci loci in DN patients were a/a 51.85%and A/A+A/a 48.15%,allele frequency were A 25.00%and a 75.00%,respectively.Comparison between two groups of patients with ApaⅠ,TaqⅠloci of genotype frequency and allele frequency,there were no statistically significant difference (all P＞0.05).②aa and Aa genotype in ApaⅠ were risk factors of DN(OR=6.313,5.525;P=0.018,0.034).Conclusion aa and Aa genotypes are risk factors of DN.

Type 2 diabetes;Vitamin D receptor;Gene polymorphism;Diabetic nephropathy

R744.51

A

1673-7210（2015）03（c）-0069-04

2014-12-25本文编辑：卫 轲）

云南省科技计划项目（编号2009CD086）；云南省教育厅科学研究基金项目（编号2013Y286）；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金项目（编号2014 FB029）。