粒细胞集落刺激因子对辐射诱导间充质干细胞远期损伤的作用及其基因芯片分析

黄 颂 邢永华 张俊伶 路 璐 李程程 李德冠 孟爱民北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192

粒细胞集落刺激因子对辐射诱导间充质干细胞远期损伤的作用及其基因芯片分析

黄 颂 邢永华 张俊伶 路 璐 李程程 李德冠 孟爱民
北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192

目的研究粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）对辐射诱导间充质干细胞（MSCs）远期损伤的作用及其可能分子机制。 方法将30只SPF级C57BL/6雌性小鼠均分为对照组、6 Gy照射组、6 Gy照射+G-CSF组。获取各组小鼠MSCs细胞后进行全基因表达基因芯片分析。对差异表达的基因进行基因本体功能分类分析，并在京都基因和基因组百科全书生物信息数据库中进行通路富集分析。 结果经6 Gy照射后小鼠MSCs中表达上调最显著的20个基因中，有12个基因在6 Gy+G-CSF组小鼠MSCs中表达下调（Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2）。经6 Gy照射后小鼠MSCs中表达下调的所有基因中，有10个基因在6 Gy+G-CSF组小鼠MSCs中的表达上调（Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm）。以上基因主要富集在细胞因子及其受体间相互作用通路、细胞凋亡及细胞周期调节通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、p53信号通路中。 结论 G-CSF可能对辐射诱导MSCs远期损伤有修复作用，其分子机制可能与调节细胞周期、抑制细胞凋亡、促进细胞分化及促进免疫应答有关。

G-CSF；间充质干细胞；辐射；基因芯片

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）最早发现于骨髓的非造血系，是一类具有自我更新、多向分化潜能的成体干细胞。MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及基质细胞。MSCs不仅能够支持造血、调节免疫功能，当机体受到损伤时，MSCs还会靶向迁移至受损组织和炎性反应位点，参与机体的损伤修复过程[1]。当MSCs受到电离辐射后，其细胞内活性氧（ROS）水平升高，ROS过量生成并在细胞内积聚，引起氧化应激反应，导致MSCs自我更新和多向分化功能受到损伤，以致机体受损时不能及时进行修复，甚至肿瘤发生[2]。

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是临床用于救治辐射损伤的重要造血细胞因子，具有动员骨髓和外周血中MSCs的功能，能使骨髓和外周血中MSCs的数量显著增多[3-4]，但其作用机制尚不明确。本研究利用小鼠全基因组表达谱芯片技术对接受全身照射小鼠骨髓MSCs的基因表达进行分析，观察辐射对受照小鼠MSCs基因表达的远期影响以及应用G-CSF治疗对受照小鼠MSCs基因表达调节作用及其可能机制提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清和α-MEM培养基均购自于Gibco公司（USA）；重组人粒细胞刺激因子购自于杭州九源基因工程有限公司；CO2细胞培养箱购自于Thermo Scientific公司；137Csγ射线辐射源、USD Autocell40购自于加拿大原子能有限公司。

1.2 实验动物

SPF级C57BL/6雌性小鼠30只，18～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2009-0017，饲养于中国医学院放射医学研究所实验动物中心。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及给药方法 实验分为对照组、6 Gy照射组、6 Gy照射+G-CSF组，每组10只小鼠。用137Csγ射线辐射源以1 Gy/min的剂量率，对6 Gy照射组和6 Gy照射+G-CSF组小鼠进行6 min照射，以达到6 Gy的照射剂量。对三组小鼠进行灌胃给药。对照组每只小鼠给予200 μL生理盐水，每日两次；6 Gy照射组每只小鼠给予200 μL生理盐水，每日两次；6 Gy照射+G-CSF组每只小鼠给予G-CSF药液200 μL（1 μg G-CSF/200 μL生理盐水），每日两次。照射当日分别于照射后2、6 h给药，照射后连续给药6 d，共给药14次。

1.3.2 小鼠间充质干细胞的获取 照射后2个月取材，无菌分离小鼠双侧股骨胫骨，参照文献中的方法分离培养MSC细胞[5]。在37℃，5%CO2的孵箱培养5 d后收集各组MSC细胞。

1.3.3 RNA处理及小鼠全基因组表达谱芯片检测MSC细胞加入Trizol后送交上海康成生物公司进行基因芯片的操作分析。主要步骤包括：①RNA提取及浓度的检测后，用InvitrogenTMSuperScriptR逆转录试剂盒合成cDNA。②使用NimbleGen One-Color DNA标记试剂盒对cDNA进行标记，然后利用NimbleGen杂交系统进行杂交反应。③NimbleGen Wash Buffer试剂盒洗净后，用Axon GenePix 4000B扫描仪进行扫描。将扫描后得到的TIFF格式图像导入NimbleScan软件（2.5版本）进行表达数据分析。④表达数据通过NimbleGen软件包含的四分位数标准化和Robust Multichip Average（RMA）算法进行标准化后，将所有基因水平的文件导入Agilent GeneSpring GX软件（11.5.1版本）进行进一步分析。本研究中，以表达倍数的变化程度（≥1.5倍）确定差异表达的基因，无监督层次聚类则利用 Agilent GeneSpring GX软件（11.5.1版本）进行。

1.3.4 GO功能分类及通路富集分析 利用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）软件对差异表达的基因进行基因本体（gene ontology，GO）功能分类分析，并依据京都基因和基因组百科全书生物信息数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物信息数据库进行通路富集分析。

2 结果

本研究采用的基因芯片为Roche NimbleGen公司的小鼠12×135K全基因组表达谱芯片，包含源于NCBI及其他权威数据来源的共约44 170个基因。研究结果显示，6 Gy照射组小鼠的MSCs基因表达与对照组相比发生了明显的变化，基因芯片分析有意义上调基因中差异最显著的前 20个分别为 Vangl1、Limk1、L1cam、Cks1b、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Cks2、Mapk8、Afp、Lep、Ntn3、Ccnb1、Prickle1、Ccna2、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2。这些基因表达上调的倍数为3.16～75.91倍（图1）。分析6 Gy照射+G-CSF组小鼠MSCs的基因芯片数据发现，以上20个基因中，有12个基因在给予G-CSF后表达下调，分别为Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2。这些基因在给予G-CSF后表达下调倍数为2.06～77.94倍（图2）。在这12个下调基因中，Vangl1、L1cam、Id1、Itgb3在6 Gy照射后+G-CSF组中的表达恢复正常（图3）。而在6 Gy照射组与对照组小鼠MSCs基因芯片分析得出的有意义下调基因中，有10个在6 Gy照射后给予G-CSF组中表达上调，分别为 Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm（图2）。在此10个基因中，Ccl19、Ccl21a、Tnnt2在6 Gy照射+G-CSF组中表达恢复正常（图4）。

将上述差异表达基因利用KEGG生物信息数据库，以DAVID软件进行通路富集分析后结果如表1所示。

3 讨论

间充质干细胞由于具有修复多种组织损伤的功能，现在已成为许多研究的热点，并被广泛应用于临床的细胞治疗[6-7]。MSCs不仅具有易于获取、增殖和分化能力强、适宜同种异体移植等优势[8]，而且还能分泌大量具有免疫调节功能的细胞因子、生长因子，这些细胞因子和生长因子进一步使MSCs具有调节固有免疫应答和适应性免疫应答的能力[6，9]。另外，由于一些分子信号通路的激活使细胞因子的表达上调，因此MSCs具有向辐射诱导损伤位点靶向迁移并对其进行修复的能力[10]。MSCs具有支持骨髓造血的功能，且具有一定程度的辐射抗性，因此可修复辐射对骨髓基质和造血微环境的损伤，有利于造血重建[11]。辐射诱导MSCs细胞周期阻滞，克隆形成能力下降，细胞内ROS积聚增多，并导致MSCs的DNA和干性受损[2，10]。GCSF作为临床治疗辐射暴露患者的首选药物，能够有效地动员MSCs增殖及释放细胞因子[12]。为了探讨GCSF对辐射诱导MSCs远期损伤的作用及其可能的分子机制，本研究采用基因芯片的方法对照射后给予G-CSF小鼠的MSCs基因的表达进行了研究。

基因芯片的分析结果发现，与正常对照组比较，在6 Gy照射组小鼠MSCs中表达上调最显著的20个基因中，有12个基因其在6 Gy照射+G-CSF组小鼠MSCs中的表达下调（Vangl1、L1cam、Hdac2、Polk、Id1、Ttc37、Afp、Ccnb1、Ikbkg、Mad1l1、Itgb3、Rrm2）。另外，与正常对照组比较，在6 Gy照射组小鼠MSCs中表达下调的基因中，有10个基因其在6 Gy照射+GCSF组小鼠 MSCs中的表达上调（Ccl19、Ccl21a、G6pc2、Igf1、Tnnt2、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、Acaca、Oxsm）。这些基因在功能上主要调节免疫系统，细胞增殖与代谢，细胞周期和凋亡。通过对以上差异基因进行KEGG通路富集分析，我们发现差异基因主要富集在细胞因子及其受体间相互作用通路（Ccl19、Ccl21a、Ifna6、Tnfrsf14、Il13、G6pc2、Ikbkg、Acaca、Oxsm）、细胞凋亡及细胞周期调节通路（Hdac2、Ccnb1、Mad1l1、Ikbkg）、PI3K-Akt信号通路（G6pc2、Igf1、Ifna6、Ikbkg、Itgb3、L1cam）、NF-κB信号通路（Ccl19、Ccl21a、Ikbkg）、p53信号通路（Ccnb1、Rrm2）中。综合文献报道和基因芯片的生物信息学分析结果，L1CAM可以结合到酪氨酸激酶受体（RTKs）及整合蛋白，导致细胞外信号调节激酶（ERK）活化，从而促进细胞周期进程，诱导血管生成和通过激活磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路来诱导细胞凋亡[13]。MAD1L1不仅能够促进细胞在分化过程中退出细胞周期从而抑制细胞增殖，还能诱导细胞凋亡[14]。ITGB3作为整合素家族的一员，通过PI3K通路对细胞周期、细胞凋亡、细胞存活均有调节作用[15]。ID1可以通过与碱性促黄体激素蛋白结合而抑制细胞分化[16]。当VANGL1表达受到抑制时，通过对Wnt信号通路的调节可显著减少肝癌细胞数量并诱导肝癌细胞死亡[17]。CCNB1调节细胞从G2期向M期的转换，且在肿瘤组织中普遍高表达，作为一种细胞周期进程调节剂在肿瘤细胞内的表达量是判断肿瘤恶性程度高低的指标之一[18-19]。IGF1可以通过减少G1期细胞数量，增加S期与G2～M期细胞来促进细胞的增殖和分化[20]。白细胞介素-13（IL-13）是T细胞分泌的细胞因子，具有调节单核细胞和B细胞功能以及抑制促炎症细胞因子生成的作用[21]。CCL19、CCL21为重要的趋化因子配体，不仅能够诱导树突状细胞（DCs）的成熟和迁移，还能直接调节DCs启动T细胞应答。CCL19和CCL21与趋化因子受体CCR7共同作用，在适应性免疫应答过程中发挥重要作用[22]。

综上所述，本研究表明骨髓间充质干细胞在全身照射小鼠远期基因调节仍有显著改变。提示G-CSF不仅对造血干细胞、造血祖细胞有促进增殖和动员的功能，G-CSF可能对辐射造成的MSCs远期损伤有促进修复和功能调节作用。其分子机制可能与下调L1cam、Mad1l1、Id1、Ccnb1等调节细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制细胞分化基因的表达从而增强MSCs增殖分化功能有关；或与上调Ccl19、Ccl21a、Il13等免疫相关基因的表达有关。这一基因芯片的结果为探讨G-CSF对辐射诱导小鼠MSCs远期损伤作用的分子机制提供了思路，反映了给予G-CSF后小鼠MSCs内编码这些蛋白质的mRNA表达量的改变，但还需要有后期蛋白质功能实验的支持，以及分子生物学方法验证这些基因调控的信号途径。

[1]Deans RJ，Moseley AB.Mesenchymal stem cells：biology and potential clinical uses[J].Experimental Hematology，2000，28（8）：875-884.

[2]Hou J，Han ZP，Jing YY，et al.Autophagy prevents irradiation injury and maintains stemness through decreasing ROS generation in mesenchymal stem cells[J].Cell Death &Disease，2013，4（10）：e844.

[3]Ripa RS，Haack-Sorensen M，Wang Y，et al.Bone marrow derived mesenchymal cell mobilization by granulocytecolony stimulating factor after acute myocardial infarction：results from the stem cells in myocardialinfarction（STEMMI）trial [J].Circulation，2007，116（11 Suppl）：124-130.

[4]Zhang C，Zhang X，Chen XH.Granulocyte-colony stimulating factor-mobilized mesenchymal stem cells：a new resource for rapid engraftment in hematopoietic stem cell transplantation[J].Medical Hypotheses，2011，76（2）：241-243.

[5]Zhu H，Guo ZK，Jiang XX，et al.A protocol for isolationand culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone[J].Nature Protocols，2010，5（3）：550-560.

[6]Hoogduijn MJ，Popp F，Verbeek R，et al.The immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells and their use for immunotherapy[J].International Immunopharmacology，2010，10（12）：1496-1500.

[7]Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells[J].Nature，2001，414（6859）：105-111.

[8]Mylotte LA，Duffy AM，Murphy M，et al.Metabolic flexibility permits mesenchymal stem cell survival in an ischemic environment[J].Stem Cells（Dayton，Ohio），2008，26（5）：1325-1336.

[9]Caplan AI.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J].Journal of Cellular Physiology，2007，213（2）：341-347.

[10]Francois S，Bensidhoum M，Mouiseddine M，et al.Local irradiation not only induces homing of human mesenchymal stem cells at exposed sites but promotes their widespread engraftment to multiple organs：a study of their quantitative distribution after irradiation damage[J]. Stem Cells（Dayton，Ohio），2006，24（4）：1020-1029.

[11]Li M，Wang LS，Luo QL.Mesenchymal stem cells applied in therapy for acute radiation injury[J].Journal of Experimental Hematology，2007，15（4）：905-908.

[12]Gaafar T，Osman O，Osman A，et al.Gene expression profiling of endometrium versus bone marrow-derived mesenchymal stem cells：upregulation of cytokine genes[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，2014，395（1-2）：29-43.

[13]Peng ZY，Han YM，Wang J.Research progress of L1-CAM in tumor tissues[J].Journal of Modern Oncology，2013，21（3）：665-668.

[14]Mcarthur GA，Laherty CD，Queva C，et al.The Mad protein family links transcriptional repression to cell differentiation[J].Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology，1998，63：423-433.

[15]Huveneers S，Truong H，Danen HJ.Integrins：signaling，disease，and therapy[J].International Journal of Radiation Biology，2007，83（11-12）：743-751.

[16]O'toole PJ，Inoue T，Emerson L，et al.Id proteins negatively regulate basic helix-loop-helix transcription factor function by disrupting subnuclear compartmentalization[J]. The Journal of Biological Chemistry，2003，278（46）：45770-45776.

[17]Yanyu R，Hamamoto R，Furukawa Y，et al.Isolation and characterization of a novel human gene，VANGL1，as a therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J].International Journal of Oncology，2002，20（6）：1173-1178.

[18]Jin SZ，Wu N，Liu LB，et al.Experimental studies on radiation-induced expression changes of genes related to cell cycle control and DNA damage response[J].Radiation Protection，2010，（2）：70-79.

[19]Zhang L，Chen RS，Zhang T，et al.Study in targeting to Cyclin B1 against malignant tumors [J].Chinese Journal of Cell Biology，2008，30（5）：574-580.

[20]Wu JY，Wang YH，Wang GJ，et al.Low-power GaAlAs laser irradiation promotes the proliferation and osteogenic differentiation of stem cells via IGF1 and BMP2[J].PloS One，2012，7（9）：e44027.

[21]O'reilly S.Role of interleukin-13 in fibrosis，particularly systemic sclerosis[J].BioFactors（Oxford，England），2013，39（6）：593-596.

[22]Comerford I，Harata-Lee Y，Bunting M D，et al.A myriad of functions and complex regulation of the CCR7/ CCL19/CCL21 chemokine axis in the adaptive immune system[J].Cytokine&GrowthFactorReviews，2013，24（3）：269-283.

Microarray analysis and the effect of G-CSF on ionizing radiation induced long term mesenchymal stem cells injury

HUANG Song XING Yonghua ZHANG Junling LU Lu LI Chengcheng LI Deguan MENG Aimin
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Tianjin 300192, China

ObjectiveTo study the effect of G-CSF on ionizing radiation (IR)induced long term mesenchymal stem cells (MSCs)injury and its possible molecular mechanisms.Methods 30 SPF C57BL/6 female mice were divided into control group,6 Gy irradiation Group,6 Gy irradiation+G-CSF administration group equally,RNA of mice's MSCs was extracted from the mice of three groups,and then biotin-labeled cDNA was generated by reverse transcription of mRNA for hybridization with Roche NimbleGen 12x135K mouse gene expression microarrays.The differentially expressed genes with 2-fold change were identified.Gene ontology enrichment analysis and pathway analysis based on Kyoto Encyclopedia of genes and genomes database were used to distribute the differentially expressed genes into biological processes and pathways.Results Among top 20 of up-regulated genes in 6 Gy group compared to control group, 12 genes were down-regulated in 6 Gy+G-CSF group (Vangl1,L1cam,Hdac2,Polk,Id1,Ttc37,Afp,Ccnb1,Ikbkg, Mad1l1,Itgb3,Rrm2).10 genes were up-regulated in 6 Gy+G-CSF group while down-regulated in 6 Gy group(Ccl19, Ccl21a,G6pc2,Igf1,Tnnt2,Ifna6,Tnfrsf14,Il13,Acaca,Oxsm).Pathway analysis based on KEGG database showed all the differentially expressed genes described above were mainly associated with cytokine-cytokine receptor interaction pathway,cell cycle and cell apoptosis regulation pathway,PI3K-Akt signaling pathway,NF-κB signaling pathway and p53 signaling pathway.Conclusion G-CSF may repair the IR-induced long term MSCs damage,and its molecular mechanisms may relate to regulation of cell cycle,inhibition of cell apoptosis,promotion of cell differentiation,or improve the immune response.Further researches are required to clarify the related signal transduction pathways.

G-CSF;MSCs;Radiation;Microarray

R329.2

A

1673-7210（2015）03（c）-0009-05

2014-12-20本文编辑：任 念）

国家自然科学基金海外合作基金项目 （编号81129020）；国家重点基础研究发展计划项目（“973”计划）（编号2011CB964800-G）；国家自然科学基金面上项目（编号81372928）。

黄颂（1988.2-），女，北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所2012级放射医学专业在读硕士研究生；研究方向：放射医学。

孟爱民（1963.4-），女，硕士，博士生导师；研究方向：造血免疫损伤及肿瘤治疗领域的药理毒理学研究。