SLCO1B1基因多态性与新生儿高胆红素血症的关系▲

陆岸锋 钟丹妮 谢湘芝

(广西医科大学第一附属医院儿科，南宁市 530021，E-mail:luanfeng301301@163．com)

新生儿高胆红素血症(简称高胆)是我国新生儿住院的主要原因，但目前仍有较多病例病因不明。近年研究表明新生儿高胆与遗传因素存在密切关系［1］。有机阴离子转运因子2(organic anion transporter 2，OATP2)是一种肝细胞基底膜上转运胆红素等物质的重要转运体，由有机阴离子转运体1B1(solute carrier organic anion transporter family member 1B1，SLCO1B1)基因编码。SLCO1B1基因突变可抑制OATP2转运胆红素入肝的能力，使胆红素清除减慢，未结合胆红素在体内积聚致新生儿高胆。近来研究显示，SLCO1B1基因多态性可能与新生儿高胆发生相关。本研究检测SLCO1B1基因SLCO1B1 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597C/T 这4个突变位点，旨在探讨SLCO1B1基因不同突变类型与本地区不明原因新生儿高胆之间的关系。

1 资料与方法

1．1 临床资料 纳入标准:广西籍(即父母均是广西人)足月新生儿，日龄2 ～14 d，出生体重2．5 ～4．0 kg;经医院伦理委员会批准，患儿家属签署知情同意书。病例组:收集2012年1月至2013年12月我院新生儿科收治的高胆新生儿 121例，男 65例，女 56例，出生体重(3 196．0 ±360．0)g，胎龄(272．7 ±8．2)d，日龄(4．5 ±2．8)d;母乳喂养108例，人工喂养13例;黄疸发病时间在出生2周以内，胆红素水平达到美国儿科学会指南［2］推荐的大于35周胎龄新生儿光疗干预标准。以间接胆红素升高为主，经光疗及药物治疗黄疸消退出院。对照组:同期随机选取87例在我院产科出生的健康新生儿，在医院观察3～5 d，出院后随访至2周，出生后无黄疸或胆红素值均低于光疗干预标准，其中男57例，女30例，出生体重(3 107．0 ±411．0)g，胎龄(272．6 ±8．5)d，日龄(3．6±3．2)d，母乳喂养78例，人工喂养9例。排除早产儿、先天畸形、母婴血型不合导致的溶血、G-6PD缺乏、低出生体重儿、缺氧窒息、巨大儿、败血症儿、头颅血肿、低血糖、消化道畸形、红细胞增多症及母亲妊娠期间合并妊高征、贫血、感染、糖尿病等影响黄疸程度的因素。两组间性别、出生体重、胎龄、日龄、喂养方式等差异无统计学意义(P＞0．05)，具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取:采集新生儿外周血2 ml以EDTA抗凝，应用血液基因组提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取基因组DNA。

1．2．2 引物设计:参考文献［3-4］及设计扩增SLCO1B1基因第5、6外显子共2对引物，见表1。

表1 SLCO1B1基因扩增引物

1．2．3 聚合酶链式反应(PCR):PCR 反应总体积50 μl，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，循环 36 次，72℃终延伸5 min。反应产物5 μl在用溴乙啶染色的2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察，鉴定产物。

1．2．4 酶切产物及分析:取扩增 c．388A/G的 PCR产物10 μl用Fermentas内切酶TaqI 65℃消化5 h。取酶切产物10 μl，3．5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外灯观察结果。

1．2．5 PCR 产物测序:将扩增 c．521T/C、c．571T/C 及c．597C/T的合格PCR反应产物进行正向测序(北京六合华大基因科技股份有限公司)，测序结果与基因文库中的SLCO1B1基因序列进行比对，发现有突变的产物即进行反向测序，以保证结果的可靠性。

1．3 统计学分析 用SPSS 16．0统计软件进行数据分析，基因型频率、等位基因频率的比较采用χ2检验或者确切概率法。计量资料以(x±s)表示，采用方差分析。基因多态性对新生儿高胆影响的优势比(odds ratio，OR)和95%可信区间(CI)用二分类变量logistic回归分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 SLCO1B1 c．388A/G基因分型 PCR产物长度为214 bp，根据酶切产物片段大小分为3种基因型:151，63 bp的为野生型(AA 型);151，128，63，23 bp 的为杂合子(AG型);128，63，23 bp的为突变纯合子(GG 型)，见图1。

图1 SLCO1B1 c．388A/G位点酶切电泳图(第1条带为GG纯合子，第2条带为AG杂合子，第3条带为AA野生型，第4条带为50 bp DNA marker)。

2．2 SLCO1B1各突变位点的基因分布及等位基因频率分析 病例组和对照组 SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及c．597C/T的基因型分布及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P＞0．05)，见表2～5。提示单一存在的SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及c．597C/T突变可能与本地区新生儿高胆的发病无关。

表2 两组SLCO1B1 c．388A/G位点的基因型分布和等位基因频率比较(n，%)

表3 两组SLCO1B1 c．521T/C位点的基因型分布和等位基因频率比较(n，%)

表4 两组SLCO1B1 c．571T/C位点的基因型分布和等位基因频率比较(n，%)

表5 两组SLCO1B1 c．597C/T位点的基因型分布和等位基因频率比较(n，%)

2．3 SLCO1B1基因多态性对新生儿高胆发生的影响

SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C 及 c．597C/T 突变与新生儿高胆红素血症发生无相关性(P＞0．05)，见表6。

表6 SLCO1B1不同位点基因突变对新生儿高胆发生的影响(n，%)

2．4 SLCO1B1不同基因型组患儿总胆红素(TBIL)、结合胆红素(DBIL)、未结合胆红素水平(UCB)比较 在SLCO1B1 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及 c．597C/T同一位点的不同基因型中，TBIL、DBIL、UCB水平比较，差异均无统计学意义(P均＞0．05)，见表7。

表7 SLCO1B1不同基因型高胆红素血症患儿TBIL、DBIL、UCB 水平比较(x ± s，μmol/L)

3 讨论

OATP是一类重要的膜转运蛋白，由有机阴离子转运体基因(SLCO)编码，含有643～722个氨基酸，参与胆红素等内、外源性物质的跨膜转运［5］。人类的OATP被分为6个家族(OATP1-OATP6)，OATP2又称 OATP1B1，是一种重要的肝特异性转运体，由SLCO1B1基因编码(曾用OATP2基因表示)。SLCO1B1基因位于染色体12p12，全长108．59 kb，包括15个外显子和14个内含子，编码2 791 bp mRNA［5］。早在 2001 年，Tirona 等［6］的实验表明SLCO1B1基因突变使基因在浆膜表达的减少导致OATP2转运活性的降低，未结合胆红素未能转运至肝脏而在体内积聚引起新生儿高胆。目前发现c．388A/G和c．521T/C是东方人的主要基因突变类型。c．388A/G在中国、马来西亚、印度足月新生儿的突变率分别为79．5% 、78．2% 、54．2%［7］，高于巴西人群(白人 50．4% ，黑人 35．1%)［8］。在本研究人群中，c．388A/G 突变率为92．8%，明显高于上述人群。据报告c．521T/C在中国人群的突变频率为 14．0%［9］，而在高加索人群为 20．2%［10］。本研究显示c．521T/C的总突变率为26．0%，亦较上述人群的突变率高。而c．571T/C、c．597C/T突变率亦较 Jada等［11］报告亚洲人群的26．0%、50．0%频率高，但 c．571T/C的突变频率低于健康高加索人群(53．2%)［10］。这提示本地区人群存在SLCO1B1基因多态性，且其突变频率分布呈现地域差异性。

SLCO1B1基因突变与新生儿高胆红素血症的关系为国内外研究的热点，但目前的研究结果仍存在差异。2005年Huang［1］发现SLCO1B1基因 A388G和T521C突变是台湾地区人群发生高未结合胆红素血症的危险因素。田桂英等［12］报告SLCO1B1基因Asn130Asp(A388G突变)多态性与新生儿黄疸显著相关，携带Asp突变基因型新生儿发生黄疸危险增加。2013年Liu等［13］研究显示SLCO1B1的388位点突变与中国新生儿黄疸有关。但也有部分结果提示SLCO1B1基因突变与新生儿黄疸无关，傅雯萍等［14］报告单一存在的SLCO1B1 A388G基因突变与新生儿高胆发病无关。Prachukthum等［15］亦指出SLCO1B1基因A388G及C463A突变与新生儿高胆红素血症的发生没有相关性，Wong等［16］研究表明SLCO1B1突变不是马来西亚新生儿重症高胆红素血症的危险因素。本研究结果显示病例组与对照组各突变位点基因频率比较，差异无统计学意义(P＞0．05)，提示单一存在的 SLCO1B1 基 因 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597C/T突变可能与本地区人群新生儿高胆发病无关，与傅雯萍等［14］及 Wong 等［16］的研究结果相似。

姜敏等［17］研究结果提示，SLCO1B1基因388位点突变并不一定影响高胆红素血症的胆红素水平。而张海霞等［3］发现SLCO1B1基因的T521C多态性在新生儿高胆红素血症患儿中存在明显差异，A388G多态性显著影响新生儿高胆红素血症患儿血清胆红素水平。本研究结果显示，在121例高胆红素血症新生儿中，同一突变位点不同基因型的总胆红素水平、未结合胆红素水平及直接胆红素水平比较，差异亦无统计学意义(P＞0．05)，提示单一存在的SLCO1B1各基因型可能对本地区新生儿高胆的黄疸程度影响不大，与姜敏等［17］研究结果一致。

本研究发现SLCO1B1基因各位点突变频率较高，但单一存在的 SLCO1B1 基因 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597 C/T突变可能与本地区新生儿高胆红素血症发病无关，SLCO1B1基因同一突变位点不同基因型可能对高胆红素血症患儿血清胆红素水平影响不大。SLCO1B1各基因型对高胆红素血症发病及黄疸程度的影响可能因研究的地区及人群不同而存在差异，同时基因突变频率的差异随样本例数的增多而更真实可靠。目前已知尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)突变及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6PD)缺乏是新生儿高胆的危险因素，当SLCO1B1突变与UGT1A1突变或是G-6PD缺乏共存时，是否对新生儿高胆的黄疸程度产生累积或协同效应，仍有待更多的大样本的病例对照研究予以证实。

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