心肌缺血－再灌注—钙超载损伤的基础与临床研究

孔令恒，刘 哲，张建英，周京军

心肌缺血－再灌注—钙超载损伤的基础与临床研究

孔令恒，刘 哲，张建英，周京军

［关键词］：心肌；钙；缺血－再灌注；线粒体

作者单位：西安，710032第四军医大学基础部生理学教研室［孔令恒、刘 哲（2013级五年制临床医学本科学员）、张建英、周京军］；710021西安医学院基础医学研究所（孔令恒）

心肌缺血－再灌注损伤（ischemic－reperfusion in⁃jury，IRI）是急性心肌梗死溶栓治疗、冠状动脉成形术、心脏停跳手术过程中不可避免的伴随事件，可导致心肌顿抑、心肌梗死、心律失常，甚至因心衰致死。研究证实，心肌缺血－再灌注过程中存在Ca2＋水平的非生理性显著升高，即钙超载，它是造成心肌损伤的重要原因，这为心肌保护提供了思路；同时也指出，阐明钙超载的发生机制和损伤机理是后续工作的重要方向。

1 胞浆钙超载与心肌损伤

1．1 胞浆钠超载和钙超载的机制分析 缺血所致的心肌胞内钠超载是多因素作用的结果［1］，主要包括：①细胞内ATP水平降低，使得钠泵活动减弱；②糖酵解活动加强，细胞内酸中毒逐渐加剧，这将激活钠－氢交换体（Na＋／H＋exchanger，NHE）和钠－碳酸氢根离子同向转运体（Na＋－HCO－3cotransport⁃ er）；③膜电位降低，晚钠电流（late sodium current）增大。另一方面，缺血也造成胞内钙超载，主要原因有：①随着胞内ATP的降低，肌浆网钙泵的活动减弱；②膜电位的去极化和细胞内外Na＋浓度梯度的降低使得肌膜钠－钙交换体（Na＋／Ca2＋exchanger，NCX）处于Ca2＋内流模式；③有研究认为，缺血可使心肌膜电位去极化，L－型钙通道开放，Ca2＋内流。

缺血后再灌注早期，随着细胞外H＋的流失，NHE活动加强，与此同时，钠泵功能尚未恢复，这些因素的共同作用使得胞内钠超载仍将持续；胞内钠超载造成钠－钙交换体依旧处于Ca2＋内流模式，造成舒张期Ca2＋水平持续升高［1］；另外，在ATP水平逐渐恢复的过程中，肌浆网钙泵将不断摄取Ca2＋，同时雷诺丁受体（ryanodine receptor，RyR）发生Ca2＋漏，会产生异常性钙振荡。直至线粒体、肌浆网、钠泵等功能恢复，钙稳态才趋于正常。

根据以上理论，以改善胞内钠超载和钙超载为思路的心肌保护药物应运而生［1］。动物实验证实，抑制NHE活性可显著减轻IRI。然而临床研究存在争议，一方面，项目名为“GUARDIAN”和“ESCAMI”的多中心临床研究发现，其抑制剂卡立泊来德和依尼泊胺并未明显降低缺血性心脏病患者治疗后的死亡率或缩小梗死面积；另一方面，名为“EXPEDI⁃TIOIN”的临床研究发现NHE抑制剂对冠状动脉旁路移植术患者有一定的保护作用。动物实验表明，MCC－135兼具抑制肌浆网钙漏和NCX介导的Ca2＋内流作用，然而临床研究并未获得满意效果。KBR7943和SN－6是阻断NCX的Ca2＋内流模式的常用工具药，但是，它们能否作为临床药物还不得而知。

1．2 胞内钙超载的损伤机制

1．2．1 心肌挛缩 挛缩是心肌在缺血－再灌注过程中产生的一种病理现象，是临床“石头心”产生的重要原因。光镜和电镜下可见，线状的肌丝被挤压成团块，形成致密的“收缩带”；记录室内压时可观察到舒张期左室压力不能下降至正常水平（5～10 mm Hg）。挛缩一方面引起心肌舒张功能障碍，由此使得舒张末期心室充盈血量减少，最终造成循环衰竭；另一方面，挛缩产生的物理性张力可破坏闰盘的结构与功能，致细胞间通讯障碍，严重时将撕裂细胞膜，致细胞间隙增大，肌红蛋白等大量的细胞内容物漏出，最终导致细胞发生收缩带性坏死。

缺血与再灌注期心肌均可发生挛缩。缺血可致心脏出现一种“僵直性挛缩”，即随着缺血时间的延长，左室舒张期压力持续上升。在缺血后再灌注早期，心脏会出现“频发性挛缩”，表现为一种高频率、不依赖窦房结的自发性心肌收缩［1］。此时，舒张期室内压的变化与损伤程度密切相关，如损伤较轻，室内压将在一段时间内逐渐恢复至正常；若损伤较重，舒张期室内压将持续维持在较高水平。

目前认为，ATP耗尽是僵直性挛缩的重要原因，而胞内钙超载是导致频发性挛缩的元凶。在缺血期，ATP逐渐耗尽，这将造成结合于肌球蛋白的ADP不能被ATP置换，最终使得肌动蛋白与肌球蛋白的解离发生障碍，肌丝处于收缩僵直状态。在缺血后再灌注早期，缺血期形成的胞内钠超载将激活NCX，同时肌浆网钙释放通道也出现“钙漏”，两者共同引发自发性钙振荡，高负荷钙与肌钙蛋白的频发结合与解离最终导致心脏发生频发性挛缩［1］。

通过干预肌球蛋白与肌动蛋白的结合，以减轻挛缩，达到心肌保护作用的这一方法的有效性已得到验证。2，3－丁二酮一肟（2，3－butanedione mon⁃oxime，BDM）是首个成功研发的抗挛缩工具药，是移植心脏的保护剂。药理学研究观察到，BDM可使去膜心肌纤维张力－PCa曲线右移，显著抑制横桥ATP酶的活性，降低ATP的利用率。然而，由于BDM具有促肌浆网“钙漏”的非特异性作用，其应用受到一定限制。Blebbistatin作为一种非经典肌球蛋白横桥ATP酶的抑制剂，被用于探讨非肌细胞的有丝分裂、细胞运动等生命现象的发生机制；近年研究发现，Blebbistatin也显著抑制肌细胞横桥ATP酶的活性，半数抑制浓度（IC50）约为2 mM，这为研究影响心肌挛缩的因素提供了新的手段。

1．2．2 钙蛋白酶 钙蛋白酶也称Ca2＋依赖的非溶酶体类中性半胱氨酸蛋白酶［2］。该家族存在14个亚型（命名为钙蛋白酶1～14），1个调节亚单位和1个内源性抑制分子。蛋白质结构分析表明，各亚型包含I～IV四个重要结构域：结构域I的特征还不十分清楚，有研究发现，钙蛋白酶－1，2和9的结构域I可发生Ca2＋依赖性自水解，认为是酶活化的重要步骤；结构域II是酶的活性中心，其中半胱氨酸、天冬酰胺和组氨酸形成高度保守的催化三联体，结构域II还可结合2个Ca2＋，有助于酶的活化；结构域III含有2个Ca2＋结合位点和1个磷脂结合位点，参与酶活性的调节和对底物的识别；结构域IV含有5个EF手性结构，可结合Ca2＋、内源性抑制分子和调节亚单位，是钙蛋白酶的重要分子结构特征。需要说明的是，亚型－1和2可分别与调节亚单位结合，组成典型的m－和m－钙蛋白酶，它们是心肌的主要表达形式。

( ) 1.When I returned to my hometown, I was nearly lost. Almost_______ had changed.

钙蛋白酶与心肌IRI的关系已被广泛研究。实验发现，随着IRI程度的加重，胞内钙超载引发钙蛋白酶发生肌膜转位的数量将明显增加，再灌注期钙蛋白酶的活性显著增强。钙蛋白酶可水解细胞骨架蛋白-胞衬蛋白，功能蛋白如肌膜钠泵、肌浆网钙泵，还可水解、活化线粒体凋亡相关分子bid，最终导致肌膜破裂，线粒体功能紊乱，心功能障碍和细胞死亡［3］。MDL－28170是研究钙蛋白酶功能的常用工具药，通过与三联体结构中的巯基结合而抑制酶的活性。笔者和他人的工作均表明，MDL－28170可显著减轻急性钙超载性心肌损伤［4］。因此，钙蛋白酶有望成为临床治疗IRI的又一靶点。然而，有研究发现，钙蛋白酶增加蛋白质的泛素化，介导蛋白质降解；在高表达内源性抑制分子的小鼠，心肌出现蛋白质异常聚集。因此，钙蛋白酶对心肌蛋白质的更新作用不容忽视，钙蛋白酶抑制剂的临床应用可行性尚需做全面评价。

1．2．3 钙／钙调蛋白（calmodulin，CaM）依赖的II型蛋白激酶（calcium－calmodulin－dependent protein ki⁃nase II，CaMKII） CaMKII属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，包含由4个基因编码的a、b、g和d四种单体，每一单体包含氨基端催化域、中间调节域和羧基端结合域。羧基端结合域是同源或异源结合区，12个单体聚合形成全酶。调节域又可分为假底物区和钙调蛋白结合区。钙调蛋白是由约150个氨基酸组成的高度保守的多肽，呈哑铃状的空间结构，中间为细长的a－螺旋结构，两端各有2个Ca2＋结合位点。Ca2＋／CaM与调节域的结合将解除假底物区和催化域的相互作用，自身抑制作用消失，酶被活化；而且，CaMKII的活化可使得假底物区的Thr286／287（在b、g和d单体中为T287，在a单体中为T286）发生自动磷酸化，自此CaMKII的活化将不再依赖Ca2＋／CaM。研究还发现，氧化应激可使假底物区的Met281／282被氧化（ox－CaMKII），进而激活CaMKII。

哺乳动物心脏主要表达d亚基，根据不同剪接形式，又分为CaMKII dB和CaMKII dC。CaMKII可磷酸化L－型钙通道、肌浆网钙释放通道与钙泵，通过精确调控兴奋－收缩偶联过程中钙的周期性变化，完成频率依赖性舒张功能增强等生理现象的调节。CaMKII还可磷酸化钠通道与钾通道蛋白，提示CaMKII可作为钙负反馈调节的介质，改变兴奋－收缩偶联过程中心肌的兴奋性。

KN－62、KN－93和AIP是研究CaMKII功能的常用工具药。KN－62和KN－93可与CaM竞争性结合CaMKII的结合区，进而抑制CaMKII的活性；AIP则与底物竞争性占据CaMKII的底物结合区，抑制CaMKII对底物的磷酸化。实验观察到，缺血－再灌注激活CaMKII，抑制剂KN－93和AIP可显著减轻线粒体损伤，减少心肌死亡，表明CaMKII是防治心肌缺血－再灌注损伤的靶点。进一步研究提示，激活核转录因子NF－kB炎症信号通路，破坏细胞膜的完整性是应激条件下CaMKII致心肌损伤的重要机制［5］。线粒体或许也是CaMKII的作用靶点，研究发现，CaMKII增加线粒体钙单向转运体承载的钙电流，加速膜通透性转换孔的开放，引起心肌损伤［6］；然而，这一现象并未得到其它研究组的肯定［7］。

2 线粒体钙超载与心肌损伤

2．1 线粒体钙稳态的维持 早期的电镜结果表明，缺血－再灌注的心肌线粒体发生肿胀、出现大量的致密性沉积颗粒；生化分析证实，沉积颗粒的主要成分是Ca2＋和磷酸盐，提示，线粒体钙超载是心肌损伤的重要原因。

线粒体钙稳态的维持依赖于电压依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）、钙单向转运体（mitochondria Ca2＋uniporter）、NCX等分子［8］。VDAC位于线粒体外膜，含VDAC1、VDAC2 和VDAC3三种亚型，蛋白分子量约30 kDa，有1个a螺旋和13个b片层跨膜区。VDAC不仅对K＋、Cl－、腺嘌呤核苷酸、磷酸盐等分子有通透性，也是Ca2＋进入线粒体的首要闸门。钙单向转运体位于内膜，电导低，对Ca2＋有高度选择性，可被钌红选择性阻断。Rizzuto从MitoCarta数据库中找到了对应的编码基因，蛋白质分子量为40 kDa，含两次跨膜结构域，有“孔道”组份。进一步研究表明，完整的钙单向转运体是多分子组成的复合体，已知的成分包括职掌“传感器”作用的转运体调节蛋白－1 （uniporter regulator 1，MCU1），转运体调节蛋白－2和肩负“连接”作用的必要调节蛋白（essential MCU regulator，EMRE）［9］。线粒体外排Ca2＋主要依赖NCX，它不同于肌膜NCX，具有锂／钙交换的能力，其活性可被CGP－37157选择性抑制，因此也称为钠／锂／钙交换（Na／Li／Ca exchanger，NCLX）。此外，研究发现，线粒体还存在不依赖钠的钙外排方式，由氢／钙交换体完成，化学计量法得出，1个Ca2＋可能交换2或3个H＋。

Ca2＋、肌浆网（内质网）与线粒体间存在着复杂的相互联系［8］。采用荧光和电镜技术可观察到存在于肌原纤维间的线粒体与部分内质网膜相偶联。分离、纯化能获得内质网与线粒体相互作用的膜组分（mitochondria－associated membrane，MAM）。研究发现，多种蛋白参与内质网－线粒体偶联，如线粒体融合蛋白－2（mitofusin－2）与自身或线粒体融合蛋白－1的相互作用，具有分子伴侣作用的葡萄糖调节蛋白－75（glucose－regulated protein 75，GRP75）与VDAC和1，4，5三磷酸肌醇受体的相互绑定。内质网–线粒体偶联部位能形成微区Ca2＋信号通路，实现细胞器间的信息交流。内质网不仅影响线粒体功能，如激活丙酮酸脱氢酶、a－酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶，促进能量合成，或改变细胞命运，引发细胞凋亡或坏死；线粒体也作用于内质网，参与对钙释放通道的调控。

采用Ca2＋成像技术观察到，缺血期胞浆Ca2＋水平直接影响线粒体钙超载程度，线粒体钙单向转运体可能是这一事件的元凶。研究还发现，采用胡萝卜素和雷诺丁减少肌浆网的Ca2＋回摄与释放可明显减弱线粒体钙超载；用秋水仙素干预微管系统，解除内质网–线粒体的偶联关系，也同样阻抑内质网促线粒体的钙超载效应［10］。提示，内质网–线粒体偶联异常或许是再灌注心肌线粒体钙超载、细胞死亡的关键原因。其它线粒体钙稳态调节分子在IRI中的作用有待进一步研究。

2．2 膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）与线粒体钙超载所致心肌损伤 目前认为，线粒体mPTP是由腺苷酸移位酶、亲环素D、磷酸根转运体等分子组成的复合体［11］。它是缺血－再灌注等应激因素作用的产物，是一类非选择性通道，允许离子、水和分子量小于1．5 KDa的物质在胞浆和线粒体基质间自由交换。大量研究表明，mPTP的形成是线粒体膜电位降低、线粒体肿胀与完整性丧失的关键因素。它将导致ATP耗竭，促凋亡因子释放，最终细胞坏死和凋亡。环孢菌素是mPTP形成的抑制物，临床小样本统计资料也证实，再灌注期给予环孢菌素可显著减轻心肌损伤［12］。那么，线粒体钙超载引起的细胞死亡是否依赖于mPTP的开放？追溯mPTP的研究历程发现，这一概念起源于线粒体的Ca2＋研究。实验观察到，将Ca2＋加入至提取的线粒体悬液后，可引起线粒体内膜的通透性增大，线粒体肿胀。后续的工作发现，亲环素D缺失的细胞可耐受钙超载，提示亲环素D是Ca2＋的直接作用分子。然而，令人值得思考的问题是心肌细胞发生一次兴奋后，胞浆Ca2＋水平可以达到使离体线粒体mPTP开放的程度，但为何这一现象没有发生？此外，在细胞水平将静息胞浆Ca2＋由100 nM提升至1 mM，也不能易化mPTP的开放。因此，Ca2＋与mPTP的关系还需深入探讨。

3 展望

减轻钙超载，保护缺血－再灌注心肌的思路掀起了以钙转运体和钙依赖蛋白为干预靶点的药物研发热潮，然而临床疗效不满意、可选择的药物少等问题给研究工作带来了新的挑战。由于基础疾病如糖尿病的存在，性别、年龄等因素的影响，不同钙转运体在钙超载中的角色有待明确，是否还存在新的分子也需阐明。在钙超载致心肌损伤的分子机制研究中，不同钙依赖蛋白间的相互关系亟需明确，哪一分子发挥主导作用有待论证，药理学研究亟待加强。相信，随着对钙超载研究的深入，必将为心肌缺血－再灌注损伤的防治提供新手段。

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修订日期：（2015⁃08⁃10）

收稿日期：（2015⁃07⁃22）

通讯作者：周京军，Email：jjzhou＠fmmu．edu．cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371181）