低氧环境及不同流体静压下体外培养的人髓核细胞凋亡的变化

2015-01-22 12:05王永贵刘江涛徐俊昌庄正陵刘涛刘畅
中国临床医学 2015年4期
关键词:细胞凋亡

王永贵 刘江涛 徐俊昌 庄正陵 刘涛 刘畅

(1.湖北医药学院附属襄阳医院骨科,湖北襄阳 441021;

2.复旦大学附属金山医院外科教研室,上海 200000)



·论著·

低氧环境及不同流体静压下体外培养的人髓核细胞凋亡的变化

王永贵1刘江涛1徐俊昌1庄正陵1刘涛1刘畅2

(1.湖北医药学院附属襄阳医院骨科,湖北襄阳441021;

2.复旦大学附属金山医院外科教研室,上海200000)

摘要目的:观察体外培养的髓核细胞在低氧及不同流体静压下凋亡的变化。方法: 体外培养人退变髓核细胞,根据低氧环境随机分成2组:低氧组和正常氧分压组;然后根据不同流体静压条件再随机分为3组:不加压对照组、加压50 kPa组和加压100 kPa组;用MTT和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)测定法检测髓核细胞凋亡的变化。结果:低氧状态下髓核细胞的存活率较正常氧分压状态高,凋亡细胞减少。在不同流体压力下,50 kPa 压力组髓核细胞的凋亡阳性率与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);100 kPa压力组比对照组髓核细胞凋亡增加31.65%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:低氧和低压力环境可以减少髓核细胞的凋亡。

关键词椎间盘退变;细胞凋亡;细胞低氧;流体静压

椎间盘退变发病率很高,是引起腰腿痛的主要原因之一。目前,椎间盘退变一般采用保守治疗,但难于根治;椎间盘退变也可采用去除突出髓核、椎管扩大减压及融合治疗,但这种手术治疗仅缓解临床症状,无法恢复或重建椎间盘解剖结构和生理功能,甚至可诱发邻近节段退变。近年来,有学者从组织工程学角度对椎间盘退变进行了相关研究,但到目前为止,对于椎间盘退变的作用机制仍未阐明。有研究[1]认为,髓核细胞凋亡参与了椎间盘退变过程,并在此过程中起关键作用。因此,在椎间盘退变的病因学研究中,髓核细胞凋亡的作用机制越来越引起人们的重视,抑制髓核细胞凋亡可能成为治疗椎间盘退变性疾病的一个重要手段。本研究采用体外培养人退变髓核细胞的方法,研究在低氧及不同流体静压下髓核细胞凋亡的变化,以期明确髓核细胞凋亡在椎间盘退变中的作用机制,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机,并了解影响髓核细胞凋亡的相关因素,为今后抑制髓核细胞凋亡治疗退变性椎间盘疾病的研究提供理论基础。

1资料及方法

1.1一般资料选择在湖北省襄阳市第一人民医院(湖北医药学院附属襄阳医院)骨科接受手术治疗的40例腰椎间盘突出症患者,其中男性24例,女性16例,平均年龄(39.0±16.6)岁。根据Gries评分标准,所有患者均为重度椎间盘退变。纳入标准:以下肢疼痛为主要症状的L4~L5或者L5~S1腰椎间盘突出症患者。排除标准:合并腰椎不稳定或腰椎管狭窄症患者。进入临床研究的患者均签署知情同意书,并由医院伦理委员会审核通过。

1.2实验材料Pfu高保真Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pGEM-T载体和反转录试剂盒购自美国Promega公司;琼脂糖粉购自美国BD公司;去磷酸化酶试剂盒购自日本Takara公司;10%(体积分数)小牛血清、DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司;可控压力细胞加载装置购自上海金达生化仪器公司。

1.3实验方法本实验在湖北医药学院第四附属医院实验室完成。

1.3.1髓核细胞的分离和培养手术从后侧入路,取出椎间盘组织。用含青-链霉素双抗的0.9%氯化钠溶液浸泡椎间盘10 min,用刮匙轻轻将髓核组织从椎间盘中分离。分离纤维环组织与髓核组织时,依靠肉眼和手感等进行区分。髓核组织呈半透明胶冻状,用眼科剪容易剪碎,无韧性;而纤维环呈白色柔韧状,用眼科剪剪切时充满阻力,韧性较高。用含双抗的0.9%氯化钠溶液将髓核组织浸泡冲洗,直至无明显血迹,然后用眼科剪将其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小,放入盛有10 mL 2%Ⅱ型胶原酶的100 mL烧杯中,用磁力搅拌器搅拌约60 min。待组织完全溶解后,1000 r/min离心10 min,吸出上清液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液1 mL轻轻吹散细胞,然后将细胞吸至50 mL容量的培养瓶中,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液6~8 mL,静置于37 ℃、饱和湿度且CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养3 d。倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况,隔天换液,当细胞融合率接近90%时进行传代[2]。

1.3.2髓核细胞的洗涤及传代弃去培养液,用0.01 mol/L PBS洗涤细胞2次,弃去洗涤液。沿瓶壁加入数滴含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合消化液,轻轻晃动培养瓶,光学显微镜下观察细胞消化情况。待细胞出现皱缩、间隙加大,个别细胞变圆漂浮时,立即用含血清的培养液3 mL终止消化,并用滴管轻轻吹打细胞数次,制成细胞悬液。将细胞悬液以1000 r/min离心5 min,弃上清液,用培养液混悬细胞(体积比为1∶2)后重新接种及培养,培养条件同原代培养。取生长良好的第2代髓核细胞,参照说明书以TRIzol试剂提取总RNA,然后反转录获得cDNA,以此为模板,扩增Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。PCR反应引物:蛋白聚糖的上游引物5’-GGGTGAGGTCTTTTATGCCA-3’,下游引物5’-GCTTTGCAGTGAGGATCACA-3’;Ⅱ型胶原的上游引物5’-CAAGTCGCTGAACAACCAGA-3’,下游引物5’-GCCCTCATCTCCACATCATT-3’;Ⅰ型胶原蛋白的上游引物5’-CAACAAATCCCCACACAC-3’,下游引物5’-CACACAAAGACAAGAACGAG-3’;内参GAPDH的上游引物5’-AGAACATCATCCCTGCATCC-3’,下游引物5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 min(Bax和Bcl-2基因分别为54℃和59℃退火30 s),72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察拍照[3]。

1.3.3凋亡髓核细胞的形态观察将手术后分离的髓核组织用40 g/L戊二醛固定1 h,0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗5 min,冲洗3次;再用10 g/L四氧化锇固定1.5 h,0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗5 min,冲洗3次;然后用梯度乙醇溶液脱水,丙酮与等剂量的Epon812混合液浸透3 h,最后用Epon812包埋并60℃聚合48 h。组织切片后,40 g/L醋酸铀染色20 min,27 g/L硝酸铅染色20 min。在倒置显微镜下观察髓核组织切片中凋亡细胞形态及生长情况。另外,收集不同代次髓核细胞,当细胞融合达80%时用细胞刮刀刮取细胞,常规透射电子显微镜下制样处理,电子显微镜下观察细胞超微结构。

1.3.4低氧环境下髓核细胞凋亡的检测取生长良好的第2代髓核细胞,融合率达90%时进行传代,接种于96孔板(5000细胞/孔),以完全培养液培养6~8 h。待细胞贴壁后,随机分为2组:正常对照组和低氧组,每组设置3个复孔。低氧组以130 μmmol/L去铁草酰胺(defetoxamine,DFX)处理细胞,诱导低氧状态;正常对照组为未经处理的正常氧分压状态下细胞。24 h后两组细胞均更换成不含血清的DMEM/F12培养液,继续培养24 h后收集细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况。每孔加入10 μL MTT液(5 mg/mL),培养4 h后离心去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振荡5 min,用酶标仪检测波长570 nm处各孔的吸光值。细胞存活率=实验组吸光值/对照组吸光值×100%。

同时,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)测定法检测髓核细胞凋亡情况。按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒提供的说明书步骤进行检测,结果以细胞核中有棕色颗粒者为凋亡阳性细胞[4]。在400倍镜下,随机观察10个视野,记录阳性细胞数,以平均100个细胞中包含凋亡细胞的个数为凋亡指数(apopotic index,AI)。

1.3.5不同循环流体静压下髓核细胞凋亡的检测取生长良好的第2代髓核细胞,融合率达90%时进行传代,接种于96孔培养板(1×104细胞/孔)。细胞培养3~5 d后,将细胞随机分为3组:不加压对照组、加压50 kPa组和加压100 kPa组。在可控压力细胞加载装置中加载细胞,加压1 h后进行髓核细胞凋亡检测。按TUNEL细胞凋亡检测说明书进行,结果以细胞核中有棕色颗粒者为凋亡阳性细胞。在400倍镜下,随机观察10个视野,记录阳性细胞数,并计算凋亡细胞阳性率。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1髓核细胞凋亡形态用电子显微镜观察髓核细胞形态,各标本中均能找到凋亡细胞。凋亡细胞表现为细胞核中染色质固缩,集聚至核周边呈月牙型斑块;细胞质浓缩,与细胞膜融合形成膜表面泡状突起;受损细胞体积缩小,与临近正常细胞脱离,细胞膜内陷形成凋亡小体。

2.2低氧状态下髓核细胞凋亡情况MTT法检测结果显示,与正常对照组相比,低氧状态下髓核细胞的存活率较高。TUNEL法检测结果则显示,低氧处理后髓核细胞中凋亡细胞数减少。

2.3不同流体静压下髓核细胞凋亡情况PCR检测并计算不同流体静压下髓核细胞的凋亡率,结果显示,加压100 kPa组凋亡率为37.87%,加压50 kPa组为8.40%,对照组为6.22%。本研究的统计分析表明,50 kPa压力组与对照组相比,髓核细胞凋亡差异无统计学意义(P>0.05);而100 kPa压力组与对照组相比,髓核细胞凋亡率前者增加31.65%,差异有统计学意义(P<0.01)。

3讨论

椎间盘退变是由于椎间盘内髓核组织的营养供应不足,髓核退变后脱出,压迫周围组织,从而引起一系列不适症状。在椎间盘退变的病因学研究中,细胞凋亡的作用越来越引起人们的重视。髓核细胞是腰椎间盘组织中维持正常代谢的重要成分,有合成和修复细胞外基质等重要功能。髓核细胞退变导致腰椎间盘组织中正常髓核细胞减少,细胞凋亡增加。由于细胞凋亡在椎间盘退变中起重要作用,人们推测可通过抑制细胞凋亡以及利用干细胞和组织工程学的方法来延缓椎间盘退变[5]。近年来,有学者从组织工程学角度对椎间盘退变中髓核细胞的凋亡机制进行了一系列相关研究。其中,Gruber等[6]发现,椎间盘细胞培养液中血清撤除诱导的细胞凋亡能够被胰岛素生长因子1以及血小板衍生生长因子缓解。Wang等[7]分离小鼠颈椎间盘软骨终板细胞进行培养,向培养液中加入Fas单克隆抗体时,Bax表达增加,Bcl-2表达水平下降,凋亡细胞增加;而向培养液中加入胰岛素生长因子1可以阻断Fas单克隆抗体引起的上述改变。Park等[8]研究发现,可通过caspase抑制剂来抑制椎间盘细胞凋亡。

本研究发现,在低氧状况下退变髓核细胞中存活细胞数比对照组增加,提示体外培养的髓核细胞能够很好地适应低氧环境。有研究[3]报道,低氧环境能够保持正常髓核细胞的形态,使其持续表达类软骨表型标志物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,同时低水平表达Ⅰ型胶原,表现为低度的去分化状态。椎间盘组织为无血管组织,细胞的代谢主要为无氧代谢,能量来源于糖酵解。本研究发现,在低氧环境下细胞凋亡数目明显减少;同时在50 kPa压力下凋亡细胞数变化不明显,而100 kPa压力下凋亡细胞数明显增加,说明100 kPa压力对细胞凋亡作用明显。

综上所述,本研究发现低氧和低压力环境可以减少髓核细胞凋亡的发生,为今后临床上开展通过抑制髓核细胞凋亡来治疗退变性椎间盘疾病的研究提供了初步的理论基础。

参考文献

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Change of Apoptosis of Human Nucleus Pulposus Cells Cultured in Vitro under Hypoxic Condition and Diffe-rent Hydrostatic Pressure

WANGYonggui1LIUJiangtao1XUJunchang1ZHUANGZhengling1LIUTao1LIUChang2

1.DepartmentofOrthopedics,XiangyangHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Xiangyang441021,China; 2.DepartmentofSurgery,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200000,China

AbstractObjective:To observe the change of apoptosis of nucleus pulposus cells cultured in vitro under hypoxic condition and different hydrostatic pressure. Methods:The human degenerative nucleus pulposus cells were cultured in vitro and randomly divided into 2 groups according to hypoxic condition: the hypoxia group and the normal oxygen partial pressure group. While the nucleus pulposus cells were randomly divided into three groups according to different hydrostatic pressure: the control group without pressure, the 50 kPa pressure group and the 100 kPa pressure group. The change of apoptosis of nucleus pulposus cells was detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method and terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay. Results: As compared with that in normal oxygen partial pressure group, the proportion of survival nucleus pulposus cells in hypoxic group increased, while the number of apoptotic cells decreased. Under different hydrostatic pressure, there was no statistically significant difference regarding the apoptotic positive rate of nucleus pulposus cells between the 50 kPa pressure group and the control group (P>0.05). However, the apoptosis positive rate in the 100 kPa pressure group increased by 31.65%, compared with that in the control group, and the difference was statistically significant (P<0.01). Conclusions: Hypoxic condition, as well as low pressure condition, can reduce the occurrence of apoptosis of nucleus pulposus cells.

Key WordsIntervertebral disc degeneration;Apoptosis;Cell hypoxia;Hydrostatic pressure

通讯作者刘江涛,E-mail:Ljt@sina.com

基金项目:湖北省襄阳市科技局资助项目(编号:BK2014107)

中图分类号R681.53

文献标识码A

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