组织块贴壁法培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞及鉴定

谭元生，唐文利，王顺民，张 稳

20世纪末有研究表明，血管平滑肌细胞（VSMC）过度生长是高血压条件下血管重构的经典机制［1，2］。平滑肌细胞异常增殖和纤维化引起血管壁增厚和管腔狭窄，造成血管重构，可促进高血压等疾病的形成和发展，并可影响心、脑、肾等重要器官的结构与功能，最终导致这些器官功能衰竭，是导致心血管疾病死亡的主要原因之一。近年来随着研究进展的深入，抑制血管平滑肌增殖对心脑血管疾病的预防受到越来越多学者的关注。体外培养血管平滑肌细胞是研究血管平滑肌细胞生物特性的基础。本实验利用SD大鼠腹主动脉成功分离、培养出血管平滑肌细胞，希望能为该类实验研究提供纯度高、结构和功能良好的平滑肌细胞。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠，雄性，体重（100～150）g（由湖南中医药大学动物实验中心提供）。

1.2 仪器与试剂 倒置相差显微镜（上海光学仪器厂，中国）；荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，中国）；CO2培养箱（Thermo Forma公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司，中国）；DMEM 培养基（Hy－clon公司）；胰酶细胞消化（Trypsin－EDTA Solution）含0.25%胰酶和0.02%EDTA （碧云天，美国）；小鼠抗大鼠SMα－actin单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；3，3’－氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；青霉素钠、硫酸链霉素（碧云天，中国）。

1.3 细胞培养

1.3.1 原代培养 将SD大鼠断颈处死，在无菌条件下取其腹主动脉段，立即置于含青霉素钠、硫酸链霉素的无菌PBS液体中。将其移入超净工作台上，在盛有PBS液的培养皿上清除结缔组织，完整剥除动脉外膜。用PBS液漂洗（2～3）次后，纵向剖开血管，将血管内膜面向上平铺于培养皿上，用眼科弯镊钝性刮除内膜，以去除内皮细胞，动作轻柔以免破坏血管中膜。剪去血管两端钳夹过的组织，再用PBS液清洗3次，放入盛有含20%胎牛血清、青霉素钠100U／mL，硫酸链霉素的DMEM培养液中，用眼科弯剪反复将其剪成1 mm×1mm左右的小组织块，用弯头吸管移入培养瓶中。以0.5cm左右的间距将组织块均匀分布于培养瓶底部。轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上并向瓶内注入含20%胎牛血清、青霉素钠100U／mL，硫酸链霉素的DMEM培养液（3～4）mL，然后瓶盖旋松，置于CO2培养箱中静置5h～6h使组织块干涸并与瓶底贴壁附着后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置于（37℃，5%CO2，95%空气，保持一定湿度）CO2培养箱中3d～5d。待有细胞从组织块周围游出后换液，以后2d～3d换液1次。

1.3.2 细胞换液 当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变为黄色时，则需换液。在超净工作台上，吸弃原培养基，用PBS液轻轻冲洗2遍后，加入新鲜含20%胎牛血清的DMEM培养基4mL继续培养，也可进行半量或1／3量换液。换液时应动作轻柔，尽量不要碰到组织块。

1.3.3 细胞传代 至单层细胞铺满近培养瓶底的80%～90%以上传代。将原代细胞瓶内的培养液小心吸弃，加入PBS液2mL轻晃培养瓶冲洗细胞2次，吸弃，加0.25%胰酶液2mL在37℃消化约40s。在倒置显微镜下见细胞回缩、变圆，细胞成片收缩呈球形时，立即加入含血清培养基终止消化。然后轻轻吹打瓶壁细胞使其完全脱落，形成的细胞悬液在镜下计数，按1∶2接种。周期为5d～7d。首次传代时，脱落的组织块可以转移到新的25cm培养瓶中，静置于37℃的CO2孵箱中，按原代培养方法使组织块重新贴壁。24h后可见细胞重新贴壁生长。以后2d～3d换液1次，1周左右后细胞再次长成致密单层时即可再次传代。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去，待细胞传代至（4～7）代，即可用于实验。

1.4 平滑肌细胞鉴定

1.4.1 细胞形态学观察 用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。

1.4.2 细胞存活率的检测 消化传代的细胞悬液9滴，加入1滴0.4%台盼蓝液，混匀后3min内吸取1滴于血球计数器上，置显微镜下观察，凡着色细胞均为不正常细胞或死亡细胞。共计数1 046个细胞。

1.4.3 细胞免疫组化 第5代对数生长期的细胞悬液接种到（先放置2张7mm×22mm盖玻片）培养瓶中，培养2d～3d取出盖玻片，PBS漂洗5min×3次，4%的多聚甲醛室温下固定（20～30）min，PBS再次漂洗5min，3次，然后按照即用型SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作。

2 结 果

2.1 平滑肌细胞培养及形态学观察 原代培养6d～7d，倒置显微镜下可观察到少量细胞自组织块边缘游出，形态呈梭形或长梭形，但不是所有的组织块周边都有，渐向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，大小略有差异。传代后80%～90%的细胞可重新贴壁生长，继续培养，数量逐渐增加，4d～6d后长成致密细胞层，出现“峰－谷”状结构细胞恢复为梭形或长梭形外观，细胞大小趋于一致。

2.2 细胞存活率 台盼蓝液染色共计数1 046个细胞，其中30个阳性，约有95%以上的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。

2.3 细胞组织学鉴定 培养第5代的细胞经特异的SMα－actin免疫细胞化学染色后，胞浆着棕黄色，呈阳性表达。结果表明，所得细胞为典型的平滑肌细胞。

3 讨 论

血管平滑肌细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，其结构和功能的改变是导致高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等多种心血管病的细胞病理学基础［3］。目前常用的血管平滑肌细胞培养方法有酶消化法［4］和组织贴块法。其中，酶消化法由于所需组织量较大、实验操作复杂、消化酶价格昂贵、酶作用时间不易掌握、消化酶本身对细胞有毒性作用等原因，常常不是细胞培养的首选方法。而组织贴块法具有操作简单易行、存活率较高、纯度较高、实验重复性高等优点，成为许多研究者获取原代平滑肌细胞的重要途径。本研究采用了组织块培养法，经形态学观察及免疫组化方法鉴定和台盼蓝液染色检查细胞成活率高，形态学和功能良好。

本实验体会有：①每次实验前要仔细检查准备工作，制定具体实验步骤，先把本次实验所需的PBS、DMEM培养液、实验药品配制，分装好并移入超净工作台，检查酒精灯、酒精棉球等消毒用品，紫外下消毒30min。②严格无菌操作过程。包括实验环境与操作台面消毒、试剂消毒，以及洗手、关门、换鞋换衣等细节，处死动物后用75%酒精浸泡6min，取动脉宜在细胞培养室超净工作台内进行。③在贴壁法培养血管平滑肌细胞过程中，仍然存在一些需要注意的问题：取材时严格无菌操作，动作轻柔，避免大力牵拉血管造成损伤，不利于后期细胞的生长。④组织块不应剪切过小，1mm×1mm大小适中，组织边缘要求整齐、光滑，这样利于细胞从组织块中游离出和生长。组织块间距应为5mm，以保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，从而获得尽量多的原代细胞。

因此，在今后的类似实验中研究者应不断在实践中摸索、改进，为获取纯度、存活率高的平滑肌细胞提供扎实的基础。

本实验严格按照实验流程，整个过程严格无菌操作，最终通过实验鉴定，获得了较为理想的大鼠腹主动脉平滑肌细胞，为接下来即将进行中药含药血清干预平滑肌细胞增殖的实验提供了存活率、纯度都较高的实验材料。

［1］ 杨传华，陆峰，张翠英.高血压血管重塑与络病的相关性［J］.山东中医杂志，2005，24（11）：643－645.

［2］ Gohlke P，Lamberty V，KuwerL，etal.Vascularre modeling insystemic hypertension［J］.Am J Cardiol，1993，71：2E－7E.

［3］ 戴恩来，薛国忠，武俊斌，等.大鼠血管平滑肌细胞的贴块法培养［J］.中国儿科杂志，2007，3（2）：47－48.

［4］ 王明勇，陈枫，陈庄.酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞［J］.重庆医学，2011，12（40）：3482－3483.