帕金森病的生物标志物研究进展

张树山，朱 陶综述，余巨明审校

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病，以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等运动症状为主要表现，常伴睡眠障碍、自主神经功能紊乱和神经精神障碍等非运动症状。尽管我们在PD 发病机制研究中取得了长足进步，但PD 的诊断主要还是依靠临床症状。最近的研究显示在PD 初期的误诊比例较高，即使在专科门诊这种情况亦不少见。PD 患者一般仅在多巴胺能神经元减少50%和/或多巴胺水平降低达70%～80%的情况下才表现出典型的运动症状，但此时患者已错过治疗的最佳时机。先前的临床、病理及影像证据均显示神经变性在出现典型运动症状前的许多年就已经开始了，新近的研究主要致力于寻找临床前期或至少是运动前期的生物学标志物，此时，多巴胺能神经元相对存活较多，且神经保护治疗可能有效。本文拟将PD 生物学标志物相关研究进展综述如下。

1 临床症状

据Braak 病理分期，PD 患者一般在Braak 病理分期达3～4 期时才出现典型的运动症状，但在出现运动症状之前可出现多种非运动症状，为早期诊断PD 提供了重要线索。非运动症状主要包括嗅觉障碍、睡眠障碍、自主神经功能紊乱、情感障碍和认知损害等。

1.1 嗅觉障碍 1975 年Ansari 和Johnson 提出嗅觉障碍可能与PD 有关［1］，后Ross 发现嗅觉障碍可以早于PD 临床症状至少4 y［2］。由于嗅觉检测方法简便，它有可能成为一种筛查PD 高危人群的理想指标，但嗅觉障碍亦常见于其他中枢神经系统变性疾病，所以，嗅觉检测不能单独成为一个理想的生物学标志物。

1.2 便秘 许多临床研究发现早期PD 患者伴有自主神经功能紊乱，便秘则是比较突出的自主神经功能紊乱。相关临床研究显示，肠蠕动与PD 关系密切，长期便秘可能增加PD 的发病风险;且自主神经功能紊乱可在PD 运动症状出现前即已发生。2012 年进行的一项针对普通人群的大型队列研究结果证实便秘与PD 的发病风险有关［3］。但由于评价方法和特异性等问题，便秘也不能成为一个理想的生物学标志物。

1.3 快速眼动睡眠期行为障碍 RBD(rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD)是PD 最常见的非运动症状之一。约有20%的PD 患者RBD 先于运动症状出现，28%～45%的RBD 患者于发病后5 y 出现运动症状，发病后10 y出现运动症状的比例高达40%～65%［4］。神经影像学研究发现:合并RBD 的患者纹状体多巴胺转运蛋白(dopamine transporter，DAT)摄取率呈进行性下降，提示RBD 可能是PD的临床前生物学标志物。由于在临床实际工作中RBD 患者就诊率低且诊断程序繁杂，且缺乏特异性，将RBD 作为早期诊断PD 的生物学标志物尚存在一定困难。

1.4 抑郁症 抑郁症以情感低落、思维迟缓及意识活动减退为主要表现，在PD 典型运动症状出现之前即可存在。大约20%～40%PD 患者合并抑郁症，提示抑郁症可能成为诊断PD 的生物学标志物。但目前抑郁症与PD 运动症状之间的关系尚不十分清楚。

2 α-突触共核蛋白(α-synuclein)

目前，关于PD 早期诊断的生物化学标志物研究涉及免疫学、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等多个领域，其中以αsynuclein 最具研究前景。α-synuclein 是由140 个氨基酸组成的中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白，生理条件下，其在调节突触的可塑性和神经分化方面起重要作用，另外它是路易小体的主要成分。SNCA 基因突变可导致家族性PD 显示了α-synuclein 在PD 发病机制中的作用。α-synuclein 的集聚诱发蛋白质错误折叠，且倾向于集聚成有毒的低聚化合物，从而启动PD 的神经变性过程。因此若在脑脊液、血浆或唾液等体液标本中检测到α-synuclein，则可为诊断PD 提供重要线索。然而，翻译后修饰产生的特异α-synuclein 缺失阻碍了我们对细胞外α-synuclein 水平的直接检测。Gorostidi A等对血浆α-synuclein 单体的检测得出不确定且具争议的结论，而最近的研究显示与正常对照组比较，检测PD 患者血浆中升高的 α-synuclein 寡聚体水平具较高的特异性(85%)［5］。90%的磷酸化α-synuclein(Ser129)沉积在路易小体中，而正常脑组织中只有4%的α-synuclein 处于磷酸化状态，故磷酸化α-synuclein 在PD 发病机制中发挥重要作用。实际上，研究证实PD 患者血浆中磷酸化α-synuclein 水平高于正常对照组，而外周血单核细胞中的α-synuclein 单体水平在PD 组和对照组无明显差异，进一步的研究发现PD 组硝基化的α-synuclein 水平明显高于对照组［6，7］。

PD 的病理变化不仅仅局限在中枢神经系统，中枢病理变化与外周免疫系统相互作用已被充分研究，是否存在其它的可以影响中枢神经系统的外周机制仍有一定争议。考虑到脑脊液毗邻产生病理变化的区域，且可以反映各种条件下脑代谢的情况，许多科学家致力于研究脑脊液，希望得到可靠的PD 生物学标志物。脑脊液中α-synuclein 的检测方法刚刚建立起来，许多的变量(如脑脊液收集时间、血液污染和储藏条件等)均可显著影响结果，为了使各个研究的结果据可比性，建立一套标准检测程序就显得非常重要。即使在这种情况下，大多数的研究仍显示共核蛋白病脑脊液总的α-synuclein 水平降低［8］。但脑脊液中α-synuclein 水平下降原因不明，可能是多种机制共同作用的结果，例如寡聚体的沉积、多巴胺能神经元减少所致的蛋白分泌功能受损、蛋白翻译或加工异常。Tokuda 等研究显示PD 患者组脑脊液α-synuclein寡聚体及寡聚体/总量比值均明显高于正常对照组，其诊断灵敏度达90.60%、特异度达89.30%［9］。提示脑脊液α-synuclein 寡聚体及寡聚体/总量比值有可能成为早期诊断PD的理想标志物。

检测脑脊液和外周血中α-synuclein 水平存在诸多问题，如取材不便、样本易污染等。因此Devic 等首次利用唾液腺进α-synuclein 检测［10］，结果显示与正常对照组相比，PD 组患者唾液腺中α-synuclein 水平降低。提示唾液腺亦有可能成为新的样本来源，为PD 生物学标志物研究开辟了新的途径。

3 DJ-1

DJ-1 是参与和神经变性相关的转录调控、氧化应激反应的同源二聚体蛋白。DJ-1 基因(PINK7)突变导致罕见的常染色体隐性遗传性PD。先前有研究显示血浆DJ-1 水平在PD 组和正常对照组无明显差异，直接测定全血中DJ-1 对PD的诊断没有帮助。最近一项研究通过测定全血中经翻译后修饰的DJ-1 水平发现:经4-羟基壬烯醛诱导的DJ-1 亚型水平在PD 组明显高于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者组和正常对照组［11］，后续的研究发现PD 患者脑脊液中DJ-1 水平升高，甚至在疾病的早期这种情况就已经存在［12］。针对上述情况，研究人员联合脑脊液中DJ-1 和α-synuclein、总tau 蛋白、磷酸化tau 蛋白、β 淀粉样肽1-42、Flt3 配体和不规则趋化因子等多种指标，对特定类型的PD 患者研究发现:多指标联合应用在PD 与其它变性疾病的鉴别诊断中特异性及敏感性均较高，且和疾病的进展和严重程度存在相关关系［13］。在大多数的医院，脑脊液都不容易获得，且脑脊液蛋白测定易受血液污染影响，所以目前有研究试图寻找其他组织来源的生物标志物。最近，人们在唾液腺中发现了DJ-1，而唾液腺不易被血液污染，使其可能成为一个潜在的可实际应用的生物标志物。

4 氧化应激生物学标志物

氧化应激在PD 的发病机制中居核心地位，贯穿了神经变性发生发展整个过程。先前的研究显示PD 患者在外周血单核细胞中产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)较正常人多。每日服用左旋多巴剂量与自由基水平呈负相关关系，提示外周血淋巴细胞氧化应激水平增高是可能的致病机制，左旋多巴治疗可能存在神经保护作用;后续的研究证实在未服药的PD 患者外周血单核细胞总的活性氧和线粒体活性氧水平增加［14］;进一步证实了先前的研究结论:PD 存在线粒体功能缺陷，这种缺陷包括呼吸链复合物缺陷、细胞凋亡信号诱导的和氧化应激导致的单核细胞DNA 损伤。然而，外周血活性氧水平特异性较低，并不是一个令人满意的生物学标志物。此外，很多情况如正常老化、吸烟、运动、食物、药物等都会影响机体氧化应激水平，在实际操作中很难控制这些混杂因素。颅内清除氧自由基最重要的物质是谷胱甘肽，其生物活性依靠两个关键酶:谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S transferase，GST)，它们负责催化谷胱甘肽由还原型转变为氧化型。研究发现不仅基底节区而且外周血细胞中氧化型GPX 和GST 含量均增高，提示这些抗氧化剂可能是可靠的PD 生物学标志物。

尿酸广泛存在于包括脑脊液在内的各种细胞外液，是一种较强的抗氧化剂。研究显示高尿酸与PD 风险呈负相关，脑脊液中含较高尿酸的患者预后较好，临床进展更慢［15］。在PD 的研究中，尿酸曾被认为是一个很有希望的神经保护剂，但后续的研究结果不一致，限制了其临床应用。

5 高香草酸(homovanillic acid，HVA)

HVA 是多巴胺最重要的代谢产物。最初的研究显示PD患者脑脊液中HVA 较正常对照降低。然而，很多偏倚可以影响数据的准确性，比如HVA 由纹状体进入脑脊液通道受限，容易被持续分泌的脑脊液稀释。实际上，DATATOP 研究显示各个研究脑脊液中HVA 差异很大，所以HVA 不是一个理想的生物学标志物［16］。考虑到颅内多巴胺代谢和嘌呤代谢相互影响大，一些研究通过同时测定脑脊液中的高香草酸和黄嘌呤发现:应用高香草酸/黄嘌呤比值鉴别PD 和正常对照相对容易，且和疾病进展存在相关关系，提示其可能成为一个理想的生物学标志物［17］。

6 蛋白组学、代谢组学、转录组学

近年来质朴技术(蛋白组学、代谢组学、转录组学)的应用，使我们无需借助特异性抗体也可以检测诸如脑组织、血浆、尿液或脑脊液的蛋白图谱或代谢图谱的细微变化。蛋白组学是对特定时刻的生物样本中所有蛋白的定性和定量分析，提供了大量的可以用来比较不同疾病状态的数据，是一种没有偏倚的方法。

通过检测外周血细胞的蛋白图谱，研究人员期望从外周血单核细胞系统分离的蛋白组(包括肌动蛋白解聚因子-1、原肌球蛋白、γ-纤维蛋白原、ATP 酶β 亚基和一个基本的肌动蛋白变体)可以用于PD 的诊断。另一项蛋白组学研究显示表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一个很有希望的提示PD 认知功能减退的生物学标志物，据Chen-Plotkin报道，EGF 水平越低，PD 患者的认知功能损害越明显，且经过长时间的随访，进一步的亚组分析显示EGF 水平较低的患者更易进展为痴呆［18］。

尽管血液污染可使脑脊液的蛋白图谱发生巨变，脑脊液依然很适合用来做蛋白组学研究。最近一项蛋白组学研究也显示:另一个脑脊液蛋白组(包括脑源性神经生长因子、载脂蛋白AII、载脂蛋白E、白介素-8、A-β 42、β2-微球蛋白、维生素D 结合蛋白)作为帕金森诊断的生物学标志物优势明显［19］。

在神经变性疾病发病发展过程中，由基因、外源性物质、蛋白质调节的新陈代谢图谱有可能受到影响，且每一种疾病可能都具有独特的代谢图谱。代谢组学研究生物样品中代谢途径的小分子终产物，并通过多变量数据分析以避免混杂因素。这种方法已经成功应用于寻找多种疾病的可能生物学标志物，例如心肌梗死、精神分裂症和2 型糖尿病。最近，通过代谢组学方法研究外周血样品，研究人员得到了PD 患者和正常人的完全不同的代谢图谱，并发现PD 患者尿酸水平显著下降，而8-羟基脱氧鸟苷、丙酮酸水平明显增加［20］。

转录组是细胞所有转录产物的集合，包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和其它非编码的信使RNA，反应在某一特定时刻处于激活状态的基因表达情况。转录组学采用以DNA 微阵列技术为基础的高通量技术研究特定细胞族群的mRNA 水平。不幸的是，mRNA水平轻微变化就可以导致其编码蛋白总量的巨大差异，所以对mRNA 相对表达水平的判读就显得异常复杂。转录组学通过研究PD 患者、正常对照和动物模型的基底节区细胞的表达图谱发现不同基因的表达图谱结果不完全一致，但都存在氧化应激、线粒体功能、多巴胺转运相关基因的激活［21］。

通过对血液标本的转录组学研究发现ST13 基因表达水平较低，此基因编码热休克蛋白-70 的辅助因子，其在α-synuclein 错误折叠过程中发挥重要作用［22］，但后续的研究未能进一步证实其功能。这些候选的生物学标志物都需要基于抗原抗体的综合方法(如Western blot 或ELISA)进一步验证。而且，各种组学方法需要大量的专业技术知识，限制了其在实际工作中大范围应用。但蛋白组学图谱、代谢组学图谱和转录组学图谱作为新的PD 生物学标志物临床应用前景依然广阔，是未来的发展方向。

7 影像学标志物

7.1 经颅超声 经颅超声是诊断PD 敏感性和特异性较高的检测工具。约90%的PD 患者于疾病早期即可检测到黑质高回声，且经颅超声具有无创、无辐射、对患者依从性要求低等优点，但对操作者技术水准要求高和缺乏特异性限制了其临床应用［23］。

7.2 扩散张量成像(diffusion tensor imaging，DTI)普通的MRI 序列不能很好的显示黑质结构，DTI 可以通过测量组织内扩散的部分各向异性(fractional anisotropy，FA)而提高MRI 对黑质结构变化的敏感性。最近通过影像技术研究发现PD 患者黑质尾部FA 值均明显低于正常对照组，提示通过观察黑质尾部FA 值的变化可能有助PD 的早期诊断［24］。

7.3 PET 和SPECT PET 和SPECT 是研究PD 黑质-纹状体多巴胺能神经元生化变化和示踪剂代谢变化的重要功能影像学方法，包括突触前和突触后功能成像。联合PET 和SPECT 检测纹状体示踪剂摄取程度研究显示PD 患者组示踪剂年摄取量下降率为4%～13%，而正常对照组仅为0%～2.50%［25］。但神经影像诊断技术特异性较低，尚不能很好地鉴别PD 与其他疾病引起的帕金森综合征，如多系统萎缩(multiple system atrophy，MSA)和进行性核上性眼肌麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)等。

8 小 结

目前PD 尚缺乏有效的神经保护治疗，比较乐观的观点认为在随后的若干年里我们会在这方面取得长足进步。所以，临床上迫切需要敏感性和特异性较高的可靠的生物学标志物用于PD 的诊断，特别是用来诊断临床前期的患者，针对这部分患者早期启动神经保护治疗可能延缓疾病的进展。除了需要早期诊断疾病的标志物，我们也亟需可以反映疾病进展情况的可靠标志物，用以客观评估疾病严重程度和对症治疗或神经保护治疗的功效。未来研究的目标是在容易获取组织如外周血或唾液腺中寻找神经变性的可靠生物学标志物。但是，单一生物学标志物的诊断价值十分有限，且存在一定的局限性，因而，在PD 的诊断、鉴别诊断、疾病进展及严重程度等方面，未来的发展趋势是多种生物学标志物联合应用。

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