脂氧合酶在血管新生中的作用

胡夏云邢怡桥（审校）

脂氧合酶在血管新生中的作用

胡夏云1邢怡桥2（审校）

脂氧合酶；血管新生

血管的形成和发生是一基本的的生物学过程，在机体正常的生长发育和创伤修复过程中都具有重要意义[1]，同时对许多疾病的发生也具有重要影响，比如慢性炎症，肿瘤的生长、转移[2-3]以及非肿瘤性的血管源性疾病，如动脉粥样硬化[4-5]、早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变等许多眼病[6-7]均有新生血管形成，这些疾病严重威胁人类的健康，寻找参与血管新生的相关因素成为治疗这类新生血管性疾病的关键。研究显示，动物体内脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在细胞生长存活、增殖分化、衰老凋亡、新陈代谢和免疫调节[8]等方面发挥不同的作用。本文介绍LOX在血管新生方面的生物作用及其可能作用机制。

1 LOX概述

LOX是以铁离子为辅基的一组同工酶，具有双加氧酶和氢过氧化物酶的双重活性，专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化氢物。多不饱和脂肪酸，主要是花生四烯酸（arachidonic acid，AA），定位于膜磷脂作为细胞膜的结构成分，在一些条件刺激下释放AA，然后通过环氧合酶、LOX及细胞色素P-450三条途径被代谢。根据底物加氧位点的不同，LOX主要可分为5-、8-、12-、15-LOX四种[9]。比如5-LOX在钙的刺激下由细胞质转移到核膜上，5-LOX激活蛋白与细胞膜磷脂中释放出来的AA特异性结合，将后者呈递给5-LOX并将其激活，5-LOX催化AA，在第5位碳原子处形成羟基，生成5-羟基二十碳四烯酸（5-HETE）和白三烯B4；8-LOX则在AA的第8位碳原子处加入羟基形成8-HETE；12-LOX则催化生成12-HETE，并且还可以产生15-HETE；15-LOX-1可作用于AA和亚油酸分别生成15/12-HETE和 13-羟基十八碳二烯酸（13-SHODE），而15-LOX-2专门催化AA为15-HETE。

5-LOX主要存在于白细胞，在B淋巴细胞和肺动脉内皮细胞中也有发现[10]；12-LOX主要存在于血小板，也存在于其它细胞中，如平滑肌细胞、角质细胞、内皮细胞和肿瘤细胞；12-LOX有3种同工酶，分别是血小板型、白细胞型及表皮型[11]，其中血小板型广泛存在于人体；哺乳动物细胞内的15-LOX又可分为15-LOX-1及15-LOX-2两个亚型。15-LOX-1主要分布于网状细胞，未成熟红细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、气管支气管上皮细胞和皮肤中也有分布[12]，而15-LOX-2分布有限，主要在前列腺、肺部、皮肤和角膜中被检测到其mRNA。

2 LOX在新生血管形成中的促进作用

2.1 血管新生概述 血管新生是指在原来存在的血管结构上长出新血管的复杂的生物学过程，是细胞－细胞、细胞－基质及细胞－细胞因子相互作用的结果。外周血液循环中的血管内皮细胞充满着血管形成促进因子（比如VEGF）、血管形成抑制因子、蛋白水解酶（如MMPS）、细胞表面分子（如整合素）等[13]，正常的情况下上述各因子处于非增殖的静止状态，当某种刺激因素打破这种平衡，就会导致局部新生血管的产生。新生血管形成起始的中心环节是血管内皮细胞的增殖、迁移、分化及管腔形成，其过程大致可以分为五个阶段，第一阶段：母本血管内皮渗透性的增加；第二阶段：母本血管基底膜和细胞外基质崩解；第三阶段：穿过基底膜和细胞外基质（ECM）的内皮芽形成；第四阶段：内皮细胞移行和分裂增殖；第五阶段：内皮细胞分支和管腔形成。而AA代谢LOX产物影响内皮细胞很多功能，包括内皮细胞屏障的维持，白细胞与内皮细胞的黏附作用，内皮细胞移行、增殖、生存以及产生生物活性介质[14]。

2.2 LOX增加血管内皮细胞的通透性 血管通透性的增加使循环中的血浆蛋白进入ECM中形成一种暂时性基质，允许并支持内皮细胞和成纤维细胞内向移动，迁移的成纤维内皮细胞合成并分泌基质蛋白、蛋白聚糖、内皮细胞从而形成新的血管。VEGF又称血管通透因子，通过增加小血管内皮细胞的囊泡、细胞器、囊状结构的活性来促进内皮细胞周围血浆成分的改变，以及通过钙黏蛋白/链蛋白复合体使单层内皮细胞之间的黏附连接松解，从而提高小血管的通透性，这是其它生长因子所没有的特性。LOX催化产生的AA代谢产物被证明可以上调VEGF的表达从而增加血管通透性最终促进新生血管形成。实验[15]发现12-LOX引起的病理性血管新生主要在于它增加了VEGF的表达。Nie D等[16]证明12-LOX的抑制剂可减少人前列腺癌PC-3细胞中VEGF的表达；而过度表达12-LOX的PC-3细胞其VEGF蛋白的水平是对照组的3倍，证明12-LOX在VEGF表达的调节中发挥重要作用。同样有研究[17]发现，抑制12-LOX表达可以减弱人脐静脉血管内皮细胞（HUVESC）中VEGF引起的血管形成，而加入12（s）-HETE后则可恢复VEGF引起的血管新生作用。Romano等[10，18]发现，在人类恶性间皮瘤中，5-LOX的代谢产物5-HETE可促进VEGF转录，证明5-LOX及其产物通过提高VEGF的表达来促进新生血管的形成。

当然VEGF的作用不仅仅表现在提高血管通透性，同时具有促进内皮细胞增殖、迁移和血管形成，改变细胞外基质，上调细胞间黏附分子-1的基因表达等作用，参与血管新生形成的多个过程。

2.3 LOX引起血管基底膜和细胞外基质崩解 基底膜和ECM的崩解与多种蛋白酶的作用有关，其中基质金属蛋白酶（MMPS）构成了ECM降解的最重要的蛋白水解系统，在正常成年组织中仅低水平表达，而在血管或组织重构过程中其活性明显上调。Ye等[19]发现暴露于香烟中的小鼠引起的炎症性腺瘤中5-LOX的表达增加，同时伴随着MMP-2和VEGF表达的上调，抑制5-LOX则降低结肠腺瘤的形成和减少血管新生，及这些动物结肠中MMP-2和VEGF蛋白的表达。通过对HUVESC的研究，发现吸烟明显增加细胞增殖及5-LOX、VEGF、MMP-2和MMP-9的表达，而抑制5-LOX则可削弱上述作用[20]。5-LOX抑制剂则可以下调MMP-9在血管性疾病和癌症中的表达[21-22]。Liu等[23]在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和HUVESC实验中得出LOX抑制剂以剂量依赖的方式显著抑制了bFGF引起的CAM血管新生，HUVECs的增殖及内皮细胞的移行和分化为分枝网管状结构，而这些抑制作用是通过减少MMP-2及其活性实现的。因此上述实验均表明LOX有可能是通过上调MMPS的表达从而引起血管基底膜和ECM的崩解参与新生血管的形成过程。

2.4 LOX引起内皮细胞移行、增殖及管腔的形成微脉管内皮细胞的移行、增殖和管腔形成在血管新生中发挥重要作用，研究发现，5（S）-HETE，12（S）-HETE和15（S）-HETE都参与微脉管内皮细胞的形成和迁移。Van等[24]研究显示，缺氧引起15-LOX-1及其催化产物15（S）-HETE和12（S）-HETE在视网膜微脉管内皮细胞（HRMVEC）中的表达从而引起HRMVEC迁移，管道形成和基底膜矩阵血管生成，而LOX抑制剂可抑制缺氧引起的上述作用。此外，他们发现只有15（S）-HETE显著引起了HRMVEC的迁移，其趋化作用比20ng/mL FGF-2还要高，但5（S）-HETE、12（S）-HETE和15（S）-HETE对HRMVEC的管腔形成都有作用。Hsieh等[25]实验显示三者都能引起内皮细胞的增殖、黏附和移行，并且可以部分逆转抑制剂齐留通对内皮细胞增殖和移行的抑制作用。

内皮细胞的增殖、迁移和出芽是通过细胞-细胞外间质的黏附作用侵入血管周围间质，又通过细胞-细胞的黏附作用促进血管条索的形成。整合素是介导细胞与细胞外间质黏附作用的主要因子，而且还介导细胞的生长发育、增殖分化及细胞凋亡。在体内外实验中证明α1β1、αvβ3、αvβ5整合素均影响血管形成，其表达于血管内皮细胞的有腔面和无腔面，介导内皮细胞的迁移和毛细血管官腔的形成。另外碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是迄今发现的促进内皮细胞增殖作用最强的生长因子，研究发现，LOX可影响整合素和bFGF的表达。

Tang等[26]实验证明12-HETE通过加强后转录和蛋白激酶C依赖的方式，加强大鼠肺动脉内皮细胞和小鼠肺微血管内皮细胞αvβ3的表达，12-HETE作用1h引起αvβ3mRNA的表达，约4h到达高峰，持续16h，从而参与血管新生的过程中。Pidgeon等[27]实验显示，在前列腺癌中转染了血小板型12-LOX的PC3细胞和a431细胞或是经12-HETE处理的野生型PC3细胞和a431细胞，其αvβ3、αvβ5的表达均增加，12-LOX抑制剂则可减少αvβ5介导的细胞黏附和存活。Pidgeon等[28]研究表明，鼠Walker癌肉瘤细胞中过度表达血小板型12-LOX可上调αvβ5的合成。Zeng等[29]实验证明在人微脉管内皮细胞中5（S）-HETE引起bFGF-2的表达从而促进人微脉管内皮细胞的DNA合成，而抗bFGF-2抗体则可完全阻断5（S）-HETE引起的血管新生作用。Nie等[30]指出12-LOX抑制剂可抑制由VEGF或bFGF刺激引起的内皮增殖、迁移，而且这种作用可以通过添加12（S）-HETE而被部分消弱。

因此，LOX可能通过影响整合素和bFGF等细胞生长因子的表达从而参与内皮细胞迁移出芽、增殖及管腔形成，从而促进血管新生。

3 LOX在新生血管中的抑制作用

LOX家族分类多样，代谢产物复杂，从而发挥多样甚至是相反的生物学作用。LOX不仅具有促进血管新生的作用，对抑制血管生成也可能发挥作用，目前研究显示具有抑制作用的是15-LOX-1[31]。Viita等[32]研究显示，15-LOX-1在兔子骨骼肌中通过减少VEGF-A和PIGF蛋白翻译从而显著减弱了血管异常性病变，包括血管通透性、血管扩张、毛细血管灌注和血管数量的增加。其机制可能：①NO可以直接刺激内皮细胞增殖、移行、管腔形成以及血管重建和保持血管的完整性。VEGF-A引起内皮NO合酶蛋白的表达和增强其活性，而VEGF-A的这种作用可被15-LOX-1抑制；②VEGF-A和PIGF引起血管新生的作用是通过激活VEGFR2实现，而过氧化物酶体增值激活受体（PPAR-）调节VEGFR2和其他促进血管新生信号分子的表达，在转染了生长因子的兔子肌肉中内源性PPAR-和VEGFR2都显著增加，然而这种增加可以被15-LOX-1有效抑制。因此，15-LOX-1通过降低生长因子的mRNA水平、NO的生物活性、VEGFR2的表达而发挥其抗血管新生的功能。Vitia等[33]进一步在新西兰大白兔玻璃体腔内通过腺病毒介导15-LOX基因转染，发现VEGF-A显著增加兔眼的微血管的数量和尺寸，而15-LOX-1通过抑制VEGF-A的表达显著抑制VEGF-A的促进血管新生和血管变异性改变和由此引发的眼病理变化作用，提示玻璃体腔内15-LOX-1基因转染可能成为治疗眼部新生血管并发症的新策略。

最新研究[34]显示，在视网膜微血管内皮细胞实验中，缺氧可引起细胞增殖能力及VEGF-A、VEGF-R2的表达增加，15-LOX-1和PPAR-γ的表达下降，而15-LOX-1可通过抑制缺氧引起的VEGF家族及PPAR-γ与VEGFR2的作用，而抑制缺氧引起的视网膜新生血管形成。在体内实验中，高氧诱导小鼠视网膜新生血管病变模型中也证明相比对正常小鼠，缺氧小鼠视网膜内15-LOX-1mRNA的表达下降20%，蛋白表达显著减少42%，而通过腺病毒转染15-LOX-1使视网膜过度表达15-LOX-1后，则可抑制视网膜新生血管形成[35]。

综上所述，脂氧合酶家族中5-LOX和12-LOX可能通过影响VEGF、MPPS、整合素及bFGF等因子的表达从而参与新生血管形成的各个阶段，包括增加血管内皮细胞的通透性，崩解血管基底膜和细胞外基质，引起内皮细胞迁移、增殖出芽、管腔形成，而15-LOX主要表现的是减少VEGF及相关因子的表达而发挥抑制血管新生的作用。目前一些脂氧合酶相关的制剂已开始运用于肿瘤、自身免疫性疾病、血液病、糖尿病视网膜病变等的治疗，并且取得较好治疗效果，其应用前景广阔。但是脂氧合酶及催化产物在新生血管中的治疗作用尚处于探索阶段，其确切的作用效果和作用机制还待大量的研究进一步证明其有效性和安全性。LOX相关制剂单独或是与其它治疗措施联合应用，或有可能成为治疗新生血管性疾病的有效安全的新方法。

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（收稿：2014-04-16 修回：2014-05-18）

1浙江省丽水市人民医院眼科（丽水 323000）；2武汉大学人民医院眼科中心（武汉 430060）

胡夏云，Tel：18957093503；E-mail：huxiayunzj@163.com