CLARITY技术及其在生物学研究中的应用进展

邬国斌何剑波综述连芳审校

作者单位：530021南宁广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科

综述

CLARITY技术及其在生物学研究中的应用进展

邬国斌何剑波综述连芳审校

作者单位：530021南宁广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科

CLARITY技术是近年出现的使器官组织透明化的实验技术，对完整器官组织实现透明化后，应用免疫组化染色，在激光扫描共聚焦显微镜扫描下实现研究对象的三维成像，目前已被广泛应用于神经系统的实验研究。本文就CLARITY技术的应用现状及其展望作一总结。

生物技术；CLARITY技术；透明化；激光扫描共聚焦显微镜；三维成像

CLARITY技术是采用一种透明水凝胶替代器官组织中的脂类，固定细胞组分中的蛋白质、神经递质、DNA、RNA等物质，让器官组织变为透明且更利于大分子渗透的全新实验技术。在此基础上对完整器官组织进行化学、遗传学和光学分析，最后在细胞/分子水平上对结构完整的器官组织进行高分辨率三维成像［1］。该项新技术将生物学研究带入完整器官成像的全新领域，从根本上改变对器官组织的理解，是生物学研究领域跨时代的一个技术革新。为更好地理解和掌握该技术，以下就CLARITY技术特点及其在生物研究中的应用进展作一综述。

1 CLARITY技术的背景

三维空间重建在阐明生物体组织结构与生理功能之间以及毗邻组织之间的关系，在形态学、比较解剖学、细胞化学定位等领域研究中的重要意义已得到业内学者广泛认可。自90年代后，生物学领域中真实再现器官组织的三维图像主要应用计算机图像三维重建技术，其中最为常用的是连续组织切片的计算机三维重建技术，即对某一细微结构进行连续薄切片，然后把这一系列切片的图像，通过计算机进行处理，从而得到该结构的立体形态的一种方法［2～4］。在随后研究中，计算机图像三维重建技术在生物器官组织病理生理、肿瘤发生和发展等领域应用取得了巨大的研究成果，但也发现计算机图像重建技术步骤繁杂，受干扰因素影响很大，如计算机硬件设备、三维重建的理论计算法与显示方式的系统环境及图像的定位、压缩、自动分割相关的图像处理，极易造成三维重建结果和参数计算的数据偏差，甚至不能真实反映组织三维空间结构，严重限制了相关领域的科学研究［5～10］。多年来，研究人员一直致力于生物组织连续切片的三维重建和三维显示工作的应用及优化，以求进一步完善二维切片图像的三维重建理论及进一步提高重建速度，改善图像显示效果，以扩大应用领域，然而未能在技术上实现突破。

2 CLARITY技术的特点

2013年Chung等［1］在《Nature》科学杂志首次介绍了CLARITY技术，其核心就是应用水凝胶来替代细胞骨架结构，水凝胶骨架可以很好地与组织细胞组分，包括蛋白质、神经递质、DNA、RNA等生物信息物质结合。将细胞结构锁定之后，在电泳条件下用去垢剂洗（SDS）缓慢去除细胞上影响大分子物质渗透和光线透过的脂质成分，使研究对象成为保持完整组织结构的透明标本。由于水凝胶骨架的完整组织结构透明标本具备大分子渗透作用，因此通过免疫共沉淀方法标记目的生物物质使之发生荧光。最后在激光扫描共聚焦显微镜下观察并构建组织细胞的三维空间结构。由于组织结构在制备过程中未经过物理破坏且被水凝胶完整固定下来，因此CLARITY技术能完整准确地反映生理、病理状态下组织器官结构的细微变化。

CLARITY技术主要由以下步骤组成：⑴制备以丙烯酰胺为主要成分的水凝胶；⑵制备组织脂质清除液；⑶组织标本灌注水溶胶，通过器官组织脉管系统注入水凝胶，灌注过程避免空气注入；⑷组织标本水凝胶固定，注意隔绝空气，避免气泡形成；⑸电泳主动清除或浸泡被动清楚组织脂质，实现组织标本的透明化；⑹组织标本研究对象的荧光染色；⑺激光扫描共聚焦显微镜三维成像及数据分析。CLARITY技术流程清晰，步骤简便，易于推广，且研究对象广泛，可以应用于各种人体及动物器官组织新鲜标本，也包括福尔马林长期浸泡蛋白质固定的标本。另外针对同一透明标本可以通过反复洗脱抗原抗体，实现不同研究对象重复反复标记的不同颜色荧光，再通过激光扫描共聚焦显微镜扫描观察及三维图像重建，从而分析生理、病理状态下各种组织细胞的相互影响作用的三维空间结构变化，从整体的角度观察疾病发生、发展及治疗过程中器官组织结构的微观变化，为了解疾病的发生、发展及治疗过程提供直观依据。

3 CLARITY技术的应用

CLARITY技术问世1年多以来，相关研究的文献报道主要集中在神经系统方面的研究，可能与神经系统的脂质成分相对较多和比较容易透明化有关。2013年Chung等［1］率先报道CLARITY技术并应用该技术构建一个完整的透明小鼠脑组织结构。经免疫杂交染色后通过激光扫描共聚焦显微镜构建小鼠大脑三维空间结构图。该结构图显示了小鼠脑结构中的长段神经突触元结构、局部神经回路、神经细胞相互关系，以及一些亚细胞结构，如神经递质、蛋白复合体、核酸等。Chung等［1］应用CLARITY技术处理自闭症患者大脑组织标本，发现神经突触聚集成团，无正常有序的神经突触。Spence等［11］应用CLARITY技术制备多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）小鼠模型神经系统透明标本，观察发现脊椎神经元数量和神经突触长度均比正常对照减少。Ando等［12］应用CLARITY技术研究阿尔茨海默尔病（AD）脑三维结构，发现大脑皮质中不规则分布淀粉样蛋白沉积（Aβ），一些表现为密集沉积；另一些表现为弥漫性沉积，伴随神经纤维间断性神经炎表现，且许多神经突触局灶性密集缠结成团。Zhang等［13］制备小鼠神经系统透明标本以后，观察到神经元钙离子（Ca2+）结合蛋白1/2（NECAB1/2）在小鼠脊椎及神经节与疼痛相关的神经元细胞中广泛分布，是疼痛神经回路及相关神经元的分子标志物之一。

4 CLARITY技术的不足及展望

CLARITY作为新技术仍存在很多不足之处，需要进一步优化、改进［14］。针对标本透明化步骤时间长，过程缓慢的缺点，Yang等［15］在CLARITY技术基础上改良灌注和被动透明化过程，使透明化标本制备的时间由原来4～6周缩短为1～2周，并已实现心、肝、肺、肾、肠道甚至整只小鼠组织的透明化。除此之外，在给较大透明标本免疫标记的步骤中，虽然提高了抗体浓度和孵育时间，但被动弥散的抗体渗入透明标本的深度仍然有限，目前免疫标记500μm的透明标本已是该技术的极限［1］。未来如何实现免疫标记过程中抗体主动转移及结合仍然是一个技术革新的关键点。另外CLARITY技术不能应用于活体组织细胞中，因此也无法动态观察组织细胞的生理病理变化。有研究者提出通过基因工程技术培育具备透明化器官组织的转基因动物模型，以此为基础实现动态观察组织细胞的生理病理变化过程。

目前虽然CLARITY技术主要成功应用于中枢神经系统，但也有不少研究者尝试将该技术应用于泌尿、消化、肿瘤等方面的研究，可以预见近年将出现一个以CLARITY技术为基础的研究高潮。经过不断改良和进步，CLARITY技术必将推动生物医学研究的深入开展。

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［2014-12-29收稿］［2015-01-20修回］［编辑阮萃才］

Q503

A

1674-5671（2015）02-03

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.19

国家自然科学基金资助项目（81460426）

邬国斌。E-mail：gb.wu@163.com