聚谷氨酸微生物发酵工艺研究

郑记栓

（濮阳天健生物科技有限公司，河南 濮阳457000）

一、概述

聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA）是微生物在发酵过程中产生的一种水溶性的均聚氨基酸化合物，是具有生物可降解性、无毒的高分子物质。聚谷氨酸是一种特殊的阴离子自然聚合物，作为一种生物高分子材料，其具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒无害等优良特性，在医药、化妆品、食品、轻工、农业、园艺等各方面都有广泛的应用[4]。从发现聚谷氨酸到现在的几十年间，对于聚谷氨酸的研究仍处于实验室规模。进入21 世纪，世界个别国际知名公司，如日本味之素、明治制果，以及台湾味丹等公司开始进行聚谷氨酸的生产和应用的研究。国内部分大学如南京工业大学、浙江大学和中科院研究所也积极开展了相关的研究。由于γ-PGA 生产菌株生产能力低，商品化成本高，γ-PGA 在我国尚未实现大规模生产。因此改进γ-PGA 生产工艺，提高产量，降低生产成本，开展产业研究，对我国生物技术产业的高分子材料工业发展具有十分重要的意义。

目前，聚谷氨酸生产有化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法三种方法。其中生产γ-PGA 的微生物发酵一直是人们关注的焦点，具有生产过程易于控制，发酵产率稳，提取目标产物的产率比较高，对环境好等优点。发酵过程中主要的生产菌株有：炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)IFO 3335、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）A T CC9945A、枯草芽孢杆菌MR-141、F-2-01 等。

二、材料与方法

（一） 材料

1、菌种

地衣芽孢杆菌 （Bacilius lichenniformis CGMC C3336）由河南天健生物科技有限公司保藏。

2、培养基

（1）菌种保藏与活化培养基

LB 培养基：胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；NaCl 10 g/L；琼脂20 g/L，pH7.4。

种子培养基：K2HPO4 0.5g/L；MgSO4。7H2O 0.5g/L；葡萄糖30g/L；酵母膏5g/L；胰蛋白胨10g/L，pH7.2。

2.1.2.2 发酵基础培养基

葡萄糖80g/L；酵母膏20g/L；硝酸铵4.1g/L；NaCl 10g/L；MgSO4·6H2O 0.5g/L；CaCl2·6H2O 1.0g/L；Fecl3·6H2O 0.01g/L；味精80g/L。

（二）主要药品试剂

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（三）主要仪器设备

?

（四）培养方法

1、种子保藏和培养

菌种保藏：采用试管斜面保存法，将种子接入种子培养基，37℃培养。

种子培养：从保藏的种子斜面上挑取一环菌，接入装有装液量为50mL 的500mL 的三角瓶中，培养条件为：37℃，220r/min 摇床培养培养16h。

2、摇瓶发酵培养

以10%的接种量将种子培养液接入装液量为50mL 的500mL 挡板三角瓶中。培养条件为：200 r/min，37℃培养72h。

（五）检测方法

1、OD 值的测定

分光光度法：发酵培养液稀释25 倍置于分光光度计660nm 处测定其吸光值。

2、pH 测定方法

菌体培养液，采用pH 计测定菌液pH。

3、发酵液中葡萄糖浓度和谷氨酸浓度的测定

测定方法：采用SBA-40E 型生物传感器测定

4、γ-PGA 含量的测定

将发酵液进行15000r/min 离心10min 以除去菌体。上清液加入20ml 无水乙醇进行醇沉，然后加入等体积的蒸馏水重新水溶解，再第二次次进行醇沉。用生物传感仪测定谷氨酸单体的含量，然后对上清液用6mol/L 盐酸液（体积比1:1）在110℃约12 小时，再测定谷氨酸的含量，聚谷氨酸含量是两次测定的谷氨酸含量之差。

三、结果与讨论

（一）发酵培养基的优化

本实验确定以葡萄糖为碳源以硝酸铵为氮源利用谷氨酸钠合成γ-PGA。本研究主要考查添加氨基酸、补料方法等对聚谷氨酸的生物合成的影响，并确定最优的γ-PGA 培养基。

1、氮源浓度对γ-PGA 发酵的影响

酵母膏作为发酵培养基中的氮源，对发酵情况有很大影响。由氮源种类对PGA 发酵的影响可以看出，以生物量来看，无机氮源明显低于有机氮源，其原因为有机氮源中含有某种菌体生长必须的物质。这样没法看出无机氮源对PGA 合成的影响，另外为了节约成本，故对无机氮源与有机氮源进行复配。

表3-1 酵母膏与各种无机氮源复配对γ-PGA发酵的影响

实验表明，单独的无机氮源无法满足菌体的生长，酵母膏与NH4NO3 复配对PGA 合成影响最大。下面对这两种药品进行不同比例的复配确定最适复配比例。

表3-2 酵母膏与硝酸铵不同比例复配对γ-PGA 发酵的影响。

由以上数据可以得出酵母膏与NH4NO3 比例1:1作为氮源最为合适。

2、葡萄糖的浓度对γ-PGA 发酵的影响

葡萄糖作为碳源给菌体提供能量和能源，合理的碳氮比对γ-PGA 产量的积累和生物量的合成意义重大。固定培养基其他成分和培养条件不变，向发酵培养基中分别添加浓度为20、40、60、80、100、120、140、180和200g/L 的葡萄糖，来考察其对γ-PGA 合成的影响。其结果如下表3-3 所示：

表3-3 碳源浓度对γ-PGA 的影响

从表3-3 可以看出，葡萄糖浓度在20g/L～80 g/L 范围之内，随着葡萄糖浓度的增加而γ-PGA 的产量也明显提高，在80g/L 时γ-PGA 的产量达到最大为12g/L。在此之后随着葡萄糖浓度的增加，γ-PGA 的产量反而下降。因最终确定葡萄糖浓度为80g/L。

3、谷氨酸对γ-PGA 发酵的影响

根据合成γ-PGA 时对外源性谷氨酸的需求，如果没有外源性的谷氨酸，菌体几乎无法合成γ-PGA，而当外源性谷氨酸存在时，菌体才能合成。生产菌株中合成酶系的活力、培养基中谷氨酸的添加量直接影响γ-PGA 产量。

保持发酵培养基的其他成分和培养条件不变，再向发酵培养基中分别添加0、20、40、60、80、100、120、140、180 和200g/L 的氨基酸。来研究对γ-PGA 含量菌体量的影响，其结果如下表所示：

表3-4 谷氨酸钠浓度对γ-PGA 发酵的影响

由表3-4 可以看出，在不添加谷氨酸的培养基中，聚谷氨酸的产量是0g/L，随着谷氨酸的浓度的提高时，γ-PGA 的产量也随之提高，当浓度达到80g/L 时，γ-PGA 的产量也达到最高值，产量为10g/L，而谷氨酸钠消耗量仅有40g/L。要继续提高谷氨酸钠浓度时，产量随之下降，浓度在160g/L 时γ-PGA 无法合成产量，γ-PGA 的产量为0g/L。从生物量上来看，在一定范围内随着谷氨酸的添加量，生物量呈上升趋势。可能的原因，添加的谷氨酸在作为前体物质的同时，还提供一部分碳源，促进菌体的生长。

（二）补料发酵地衣枯草芽孢杆菌合成γ-PGA 的影响

保持葡萄糖的终浓度为80g/L，初始葡萄糖的浓度为20g/L。实验观察了在不同的时间进行补加玉米糖化液和补糖的含量。

从表3-5 可看出，在五种补糖方式中，以E 最好，及在发酵12h、24h、36h 补加糖比其他几种补糖发酵效果好。可能的原因是菌体在低浓度糖存在的条件下，葡萄糖对菌体生长的抑制作用最小的，使菌体能够快速进入对数生长期。

表3-5 不同的补糖方式对补料分批发酵的影响发酵

注释：“ -”表示不添加物质

发酵控制转速220r/min，温度恒定37℃。初始葡萄糖含量为20g/L，，并保持至48h 停止补糖，至72h 发酵结束，检测γ-PGA 产量为42.53g/L。

四、结论

（一）本论文针对地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC3336 高产菌株，从氮源浓度，葡萄糖，谷氨酸以及添加量对γ-PGA 合成的影响，对其进行发酵培养基的优化。

（二）试验确定了补料条件，当发酵液葡萄糖浓度下降到20g/L 以下时，每次补加50mL 浓度为200g/L 的葡萄糖母液至48h 结束。培养条件：转速是220r/min，温度是37℃，培养时间72h。

[1]吉川高雄(日本).高分子材料的应用[J].2001，(01)：30-31.

[2]李丽，潘昌新．高分子材料与可持续发展[J].北京师范大学学报(人文社会科学版)2001,（1）：123-127.

[3]董惠均,赵鹏,王卉等.均聚氨基酸及其应用[J].食品科学,2003,(24):163-165.

[4]洼田英俊，南部洋子.微生物生产的聚γ-谷氨酸的性质[J].化学与粘合,1994,（4）:244-246.

[5]施庆珊．γ-聚谷氨酸的微生物合成与应用[J]．精细与专用化学品，2004，(11)：20-23.

[6]游庆红，张新民，陈国广等.Y 一聚谷氨酸的生物合成及应用[J].现代化工，2002，(12):56 一59.

[7]王辉.γ-聚谷氨酸的发酵优化以及药物增溶的研究[J].河北工业大学学报，2011.(2):43-45.