细胞片技术在肌腱再生组织工程学中的应用进展

谌业帅 史冬泉 徐兴全 蒋青

细胞片技术在肌腱再生组织工程学中的应用进展

谌业帅 史冬泉 徐兴全 蒋青

腱损伤；创伤和损伤；组织工程；综述

全世界范围内每年有超过 3000 万例的肌腱或者韧带损伤，一旦肌腱受到损伤，人的运动能力甚至日常生活都会受到严重影响[1]。然而，肌腱的恢复并不是一个再生的过程，而是一个纤维化瘢痕形成的过程，这导致了它的功能障碍甚至丧失[2]。肌腱损伤传统的治疗方法包括自体移植物、同种异体移植物、异种移植物以及人工移植物。然而，这些方法都很难达到让人满意的效果[3]。自体移植物取腱处的功能影响、同种异体移植物来源的限制及异体移植物的免疫原性等缺陷，使得人们愈发迫切地想要研发出可在体外大量生产的与体内肌腱结构与功能类似的移植物。近年来，由于组织工程学的快速发展，为满足这个愿望提供了一种潜在的方法。然而，传统使用支架的肌腱组织工程学有着诸如较差的生物力学活性等缺陷，这催生了一种不使用支架的组织工程新技术——细胞片技术。在这篇综述中，笔者将主要讨论细胞片技术在肌腱再生组织工程学中的应用进展。

一、细胞片的制作方法

组织工程细胞片是利用一些组织工程的方法使细胞连同细胞外基质从培养皿表面分离下来的完整的片状结构[4]。目前用来构建组织工程细胞片的方法主要有利用温敏性培养皿和聚合纤维蛋白覆盖的培养皿[5]及使用维生素C 诱导[6]等。

1. 温敏性培养皿：温敏性培养皿是将温度反应性的聚合物 ( 如聚 N- 异丙基丙烯酰胺 ) 共价嫁接到普通培养皿表面所形成的一类培养皿[7]。在 37 ℃ 时，聚合物表面表现出疏水性，细胞可以附着于培养皿表面，而当温度降低至32 ℃ 以下时，聚合物表面则表现出亲水性，迅速水合膨胀，使细胞从表面分离下来。收获的细胞片保留有完整的细胞、细胞间连接以及细胞外基质，当其移植入其它培养皿中或生物体内时更易存活。并且由于保留的细胞外基质的黏附性，其也可以用来堆叠形成更复杂的组织结构。与使用酶消化相比，这种方式不会破坏细胞与细胞之间的连接，但是成本很高。

2. 聚合纤维蛋白覆盖的培养皿：Ⅰtabashi 和他的团队发明了一种使用薄层、可生物降解的聚合纤维蛋白覆盖的培养皿来制作细胞片的简单、新颖的方法，并获得了一些学者的青睐[8-9]。培养皿用纤维蛋白原单体和凝血酶的混合物覆盖，并储存于 4 ℃ 的温度中。细胞种植于纤维蛋白聚合物上 4 天，覆盖的纤维蛋白聚合物会被细胞分泌的蛋白酶降解，此时，就可以通过细胞刮勺来收集组织工程细胞片。使用这种方法同样可以用来制作多层复杂的组织结构，并降低了制作成本，但也增加了操作的复杂程度。

3. 维生素 C 诱导：Wei 等[6]发现维生素 C 可以通过诱导端粒酶的活性来提高细胞外基质和干细胞标记物的表达，并因此促进细胞片的形成和组织再生。并得出20 μg / ml 是最适浓度。这是一种简单、实用获取组织工程细胞片的方法，与正常培养细胞相比成本几乎没有差别。但是由于收集细胞片时需要使用胰蛋白酶消化，如果时间把握不当，可能会破坏细胞之间的连接，这对操作者的技术和经验提出了更高的要求。但是由于以上两种方法的成本较高，本方法依然有可能成为在临床上大规模应用细胞片时的首选方法。

二、细胞片修复肌腱损伤的方式

近年来，随着细胞片组织工程学的发展，组织工程细胞片已经应用于多种组织或器官的修复与再生，如心脏[10-12]、皮肤[13-15]等。在肌腱再生组织工程学中，细胞片的应用也越来越多，不同的学者利用不同的种子细胞在体内、体外对组织工程细胞片进行肌腱再生的可行性进行了研究，并获得了令人肯定的成果 ( 表 1 )。

1. 细胞片技术＋支架：Ouyang 等[16]构建了骨髓间充质干细胞细胞片，并把其覆盖于 PLGA 支架表面，再将两者的混合体卷曲成圆柱状，作为肌腱的组织工程学类似物。并通过对其进行宏观形态学、组织学、生物力学的评估，发现此类肌腱类似物可以转变成肌腱类似物，并且与单纯支架相比具有更好的生物力学性能。然而，这种体外肌腱类似物的制作方式仍然采用了支架，没有避免传统的使用支架所导致的免疫毒性等缺点，且浪费了细胞片不需要支架，可以单独具有一定形态的优势。作者也并没有进行体内试验，此方法在体内的效果存疑，距离应用于临床仍有一定距离。

2. 细胞片技术＋机械刺激：机械刺激可以导致一系列的生物学进程，包括细胞增殖与分化，细胞因子与细胞外基质的合成等，其可以增加 Ⅰ 型胶原、ⅠⅠⅠ 型胶原与肌腱特异性基因的合成，因此可以作为促进肌腱再生的一种可行方式[22-24]。此种方式不使用任何人工合成异物，可放心应用于体内。Ni 等[19]以大鼠肌腱来源的干细胞作为种子细胞，在体外构建了组织工程学细胞片，并将其缠绕在间距为 1 cm 的 U 型弹簧上，给以机械刺激，形成肌腱类似物，并将其移植入大鼠髌腱损伤模型中，发现以这种方式在体外构建的肌腱类似物可以显著促进髌腱损伤的修复。作者通过体内及体外试验充分证明了细胞片技术＋机械刺激在促进肌腱修复上的有效性，只是动物模型距离人类本身仍有一定差距，须进一步在更大、更复杂的生物上进行试验，方可慢慢地靠近临床应用。不可否认的是，利用机械刺激的方式构建肌腱类似物，既避免使用了支架，亦无需昂贵的细胞因子诱导，最终的结果也令人满意。

3. 细胞片技术＋自体肌腱移植：目前临床上治疗肌腱损伤大部分采取自体肌腱移植，然而这种方法可能会出现移植物的坏死，影响手术的效果，并导致关节功能的下降[25-26]。因此，如何促进移植物更早的恢复是一个亟需解决的问题。Mifune 等[20]使用组织工程细胞片包裹自体肌腱移植物来进行前交叉韧带的重建，并将其与肌腱移植物加细胞注射对比，发现细胞片包裹的移植物表面及骨隧道里含有更多的细胞，因此可以促进移植物早期的恢复及与骨隧道的结合。这种方式是在现有临床基础上的改进，因此更贴近临床，并由于其较好的效果，亦更有可能应用于临床。虽然细胞片加自体肌腱移植的效果不容否认，但是依然使用了自体肌腱，这并没有减少对患者的创伤，依然有可能会影响患者其它部位的功能，不符合组织工程学的初衷。

三、细胞片技术应用的优势

使用传统的种子细胞加支架方法进行肌腱再生具有介导细胞增殖与分化能力低、较差的生物力学活性及重塑潜能、细胞与支架结合的低效性等缺陷。而使用组织工程细胞片技术则可以很好地避免这些缺陷，并且使用细胞片技术，可以将细胞与支架合二为一，从而避免了使用支架所导致的免疫原性带来的不良反应，亦不存在支架降解速率与细胞增殖不相符的缺陷。现阶段，随着研究的不断深入，用来制作细胞片的种子细胞越来越多[27-28]，来源与取材已不再是一个难题，传统组织工程学方法在种子细胞来源上的优势已不复存在，而组织工程细胞片技术结合性好等优势则是传统细胞加支架组织工程学所无法比拟的。

四、细胞片技术应用的缺陷及解决方法

由于在组织工程细胞片中没有血管，使细胞片很难堆叠很多层来获得足够的体积与张力，这限制了细胞片在组织工程学中的应用。从现有研究亦不难看出，目前使用细胞片进行体内试验，应用最多的仍是大鼠模型，大鼠的肌腱，无论从体积上还是从张力上，都与人类相去甚远。为了解决这个问题，不同的学者采取了不同的方法。有学者将组织工程细胞片技术与支架结合来获得适合的体积与张力[16,29]，但这种方法浪费了细胞片不需要支架的优势，笔者认为其不是组织工程细胞片技术的发展趋势。Kamata 等[30]将细胞片移植与内皮祖细胞注射结合起来，共同作用于组织损伤部位，取得了良好的效果。Sekine等[31]将心肌细胞与内皮细胞在温敏性培养皿中共培养制作细胞片，内皮细胞在心肌细胞间亦形成了细胞网状结构，并且体外观察发现共培养细胞片中的血管生成因子明显增加；作者再通过动物实验发现，含有内皮细胞网状结构的多层细胞片组织相较于不含内皮网状结构的多层细胞片组织，可以更好地与宿主的血管连接，并促进坏死组织的修复和功能的恢复。Ren 等[32]则将人脐静脉内皮细胞种植于人骨髓间充质干细胞所形成的细胞片上来形成内皮细胞网状结构，并通过体内和体外实验证明了这种组织具有非凡的血管生成能力。然而，无论是内皮细胞注射，或是共培养，抑或是内皮细胞种植，目前的研究都处于起步阶段，仍需要大量的实验来继续论证。但是，通过现有的研究，有理由相信，随着细胞片组织工程学的发展，细胞片血管化将不再成为限制组织工程细胞片技术发展应用的难题，细胞片应用于临床亦将逐渐成为现实。

五、回顾

近年来，细胞片技术已经成为肌腱再生组织工程学中的研究热点，其拥有良好的重塑潜能、细胞支架合二为一的高效性等优势，赢得了研究者的青睐。有理由相信，随着细胞片组织工程学的进展，尤其是在细胞片血管化方面的研究，其在肌腱损伤的修复与再生中的应用前景令人看好。

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( 本文编辑：李贵存 )

Progress of cell sheet in tendon tissue engineering

SHEN Ye-shuai, SHI Dong-quan, XU Xing-quan, JIANG Qing.
Bone and Joint Disease Center, Drum Tower Clinical Medical Faculty Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu, 210008, PRC Corresponding author: JⅠANG Qing, Email: jiangqing112@hotmail.com

Tendon injuries are common diseases which could induce substantial pain and loss of functions. Current clinical therapy of tendon injury has some disadvantages, such like the limitation of the graft which have fueled the search for tissue-engineered substitutes. Many achievements have been made during past several years. Many kinds of cells nowadays have been used in an attempt to enhance the healing of tendons: fibroblast cell lines, mesenchymal stem cells ( MSCs ), embryonic stem cells ( ESCs ) and induced pluripotent stem cells ( iPSCs ). And a large number of scaffold materials also have been explored for tendon tissue engineering including natural substances ( silk, collagen ) and synthetic biodegradable materials ( poly lactic-co-glycolic acid ). Beside gene-related approaches, the approach of tendon tissue engineering also involve some physical methods like mechanical stimulation. However, the traditional tissue engineering with scaffolds has some disadvantages. Naturally derived polymers generally show good biocompatibility but low ductility whereas the synthetic polymers exhibit a high tunability but may cause negative immune response from the body, and the scaffolds can’t fully simulate the environment between cells. To avoid this, cell sheet engineering has been developed as a unique, scaffold-free method of cell processing. Ⅰn this review, some methods for making cell sheet and its application in tendon tissue engineering are described.

Tendon injuries; Wounds and injuries; Tissue engineering; Review

sn.2095-252X.2015.10.019

R686

国家杰出青年科学基金 ( 81125013 )

210008 江苏，南京医科大学鼓楼临床医学院关节疾病诊治中心

蒋青，Email: jiangqing112@hotmail.com

2014-10-21 )