大柴胡汤对高脂高胆固醇大鼠TNF-α、IL-6表达水平的影响

常一川，王凤荣

实验论著

大柴胡汤对高脂高胆固醇大鼠TNF-α、IL-6表达水平的影响

常一川，王凤荣

目的 通过研究大柴胡汤对高脂高胆固醇大鼠模型心肌组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)蛋白表达的影响，进一步阐明大柴胡汤治疗高脂高胆固醇疾病的作用机制。方法 将45只幼龄Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、大柴胡汤组3组。正常对照组正常饮食并每日给予生理盐水灌胃；大柴胡汤组、模型组以高脂饲料喂饲大鼠造模；连续10 d；实验第11天，大柴胡汤组根据给药剂含生药量为0.3 g/mL干预。每日观察大鼠的生存状态，分别在造模后10、20、30 d，测量体质量并统计。实验第30天，采用免疫组化法检测各组大鼠心肌组织内TNF-α、IL-6蛋白的表达。结果 与正常对照组比较，高脂高胆固醇模型组心肌组织内TNF-α、IL-6蛋白表达均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，大柴胡汤组心肌组织内TNF-α、IL-6蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 高脂高胆固醇能刺激机体内TNF-α、IL-6细胞因子的大量释放，大柴胡汤能较好的抑制TNF-α、IL-6蛋白表达，对高脂高胆固醇疾病有一定的防治效果。

高脂血症； IL-6； TNF-α； 大柴胡汤； 动物，实验； 大鼠

高脂血症发病率很高，尤其对心、脑、肾血管的危害重大，常常是心脑血管疾病发病的基础。其发病的危害是隐匿、逐渐，进行性和全身性。十几年来大量研究资料表明，中国高脂血症的发病率呈现逐渐增高趋势，同时高脂血症作为脑卒中、冠心病、心肌梗死、猝死的危险因素也被大量研究所验证。高脂血症是由于脂肪代谢或运转异常使血浆中的一种或多种脂质高于正常的范围的临床常见病，通常表现为血清总胆固醇(TC)或甘油三酯(TG)水平升高和(或)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平的下降。从高脂高胆固醇大鼠模型成功造模可以看出本病是一种与饮食密切相关的疾病。中医学认为本病外因是过食膏粱厚味、肥甘之品。肥甘厚味之品一般性缓，缓则脾气滞，不能化浊而生痰湿。内因是脏腑功能失调，气不化津，则痰浊壅滞，气机不畅，脉络瘀阻。与脾虚、肾虚、痰浊、血瘀密切相关[1]。目前伴随着高脂血症的发病机制研究的深入，更加重视如何早期预防心肌病变，通过降低炎性因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)，的表达，从而减少心肌的损害。

大柴胡汤煎剂由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供，依原方由柴胡、黄芩、枳实、芍药等药物组成，其功效是和解为主与泻下并用的方剂。具清热利湿并调和脾胃的功效，现已用于临床且疗效显著。为进一步探讨该临床有效复方的治病机制，本实验采用免疫组化法，检测该药作用于高脂高胆固醇大鼠后心肌组织中的TNF-α、IL-6含量的表达，为大柴胡汤的临床应用及后续研究提供更有利的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD健康雄性大鼠45只，体质量(200±25)g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK(辽)2010-0001，合格证号：0009238。

1.2 实验药物 大柴胡汤(柴胡、黄芩、枳实、大枣各15 g，半夏、大黄、生姜各10 g，芍药20 g，泽泻30 g)由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供，含生药量约0.6 g/mL，放入冰箱冷藏备用，使用时配比成0.3 g/mL溶液。

1.3 饲料 高脂饲料配方：基础饲料93.7%、猪油5%、胆固醇1%、胆酸盐0.3%[2]。

1.4 主要试剂与仪器 试剂：大鼠IL-6试剂盒(购自北京博奥森生物技术有限公司)、TNF-α试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)；复合消化液、兔抗IgG SABC、DAB显色试剂盒(均购自武汉博士德生物工程有限公司)。LEIT20MIL型倒置荧光显微镜(德国莱卡公司)；1518TC型CO2培养箱(SHEL-LAB美国)，H.H.B11.420型电热恒培养箱(上海跃进医疗器械厂)，1410090型离心机(上海手术器械厂)，1410090型血细胞计数器(上海求精生物试剂仪器有限公司)，101-1型电热鼓风干燥箱(上海沪南科学仪器厂)，DSY-2-4孔电热恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂)，RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.5 实验方法

1.5.1 分组 参照随机数字表，将SD健康雄性大鼠45只随机分为正常对照组、模型组、大柴胡汤组各15只。实验前将大鼠全部置于SPF级清洁笼内喂养，3 d后开始正式实验。

1.5.2 动物造模 正常对照组喂饲普通饲料；模型组喂饲高脂饲料；大柴胡汤组饲喂高脂饲料，大鼠均为单笼饲养，每只给予饲料100 g/d，饮水不限。

1.5.3 给药 正常对照组给予生理盐水10 mL/kg每日灌胃；模型组给予生理盐水10 mL/kg每日灌胃；大柴胡汤组给予10 mL/kg大柴胡汤制剂每日灌胃。于实验开始0、10、20、30 d分别测量其体质量；3组平行实验30 d后标本取材。

1.5.4 标本取材 各组大鼠于给药第30天各麻醉处死取材。处死前8 h禁食禁水，摘取左侧心肌组织放入生理盐水中冲洗2次，放入干燥无菌的EP管中加入10%甲醛固定，按常规方法石蜡包埋。制成5 μm厚度的切片备用。

1.5.5 TNF-α、IL-6测定 免疫组化法检测心肌组织中TNF-α、IL-6的含量。切片脱蜡至水，3% H2O2室温10 min以灭活内源性酶，蒸馏水冲洗5 min×3次。滴加复合消化液，室温20 min，PBS液冲洗2 min×3次，吸取多于液体，滴加5% BSA封闭液室温放置20 min。滴加兔抗大鼠TNF-α、IL-6抗体(1∶80倍稀释)，放入37 ℃温箱中2 h。取出后PBS液冲洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，PBS液冲洗2 min×3次。滴加SABC试剂，37 ℃ 20 min，PBS液冲洗5 min×4次，DAB显色约10 min，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水、透明、中性树胶封片。用OLYMPUS BX50光学显微镜观察，每张切片任选5个视野(×200)，用北航分析系统图像采集分析，Image-pro plus 4.5图像分析系统对图像进行半定量分析，测定每个心肌组织的阳性颗粒(棕黄色)的积分光密度(IOD)，以均值作为该样本TNF-α、IL-6的相对表达，IOD值越大，说明其蛋白表达越多。

2 结果

高脂高胆固醇大鼠心肌组织内TNF-α、IL-6含量表达水平比较见表1。

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表1结果说明，与正常对照组比较，模型组TNF-α蛋白的表达显著增高；与模型组比较，正常对照组、大柴胡汤组测得TNF-α表达显著降低;与正常对照组比较，模型组中的IL-6蛋白表达明显升高；与模型组比较，正常对照组、大柴胡汤组IL-6蛋白表达明显降低。差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

脂肪代谢或运转异常是引起高脂血症的重要原因，是诱发包括动脉粥样硬化在内的心脑血管疾病的重要危险因子[1]。有研究证实，高脂高胆固醇后主要侵袭心肌组织和动脉血管细胞，诱导其细胞分泌细胞因子、炎性因子等炎性介质，炎症在高血脂与动脉粥样硬化发生、发展及其并发症中起着重要的作用，导致一系列临床症状[2，3]。近几年来，中医药在治疗和预防动脉粥样硬化在内的心脑血管疾病方面疗效显著，且无副反应和不良反应，故积极研制中药治疗高脂高胆固醇疾病已日益成为医药科研人员的重点工作。

前期实验研究已表明,大柴胡汤显著降低高脂血症大鼠TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，同时血清ApoA-Ⅰ水平亦显著升高，而ApoB水平显著降低;同时能降低高脂血症大鼠肝脏质量与体质量的比值，作用效果呈剂量依赖关系。大柴胡汤对高血脂模型大鼠具有较好的降血脂治疗作用，改善心肌组织微循环的功效[4]。本文在前期研究的基础上，进一步证实大柴胡汤对于高脂血症大鼠血脂及炎症因子的影响。

TNF-α是由单核-巨噬细胞分泌的一个多效因子，在免疫系统发育、炎症反应、细胞凋亡和类脂代谢中起到重要的中心作用[5]。当动物体处于正常状态时，其体内的TNF-α含量浓度较低，在摄入到高脂高胆固醇后，TNF-α可迅速通过巨噬细胞、NK细胞、T细胞等多种细胞得到释放，启动早期炎症反应的发生。TNF-α的适量上升可以起到保护机体的作用，但过量的TNF-α则会造成机体免疫功能下降，阻碍疾病的恢复[6]。另外有研究证实，高脂高胆固醇机体后可促使巨噬细胞分泌大量TNF-α，且分泌量与血脂增高的含量呈正比关系[7]。

IL-6同样是由单核-巨噬细胞分泌而来，为T细胞活化因子，能激活T细胞促进细胞毒性T细胞成熟，介导B细胞增殖分化产生IgG，并能促进TH2细胞分化。已有研究表明，高脂高胆固醇大量摄入后，刺激机体巨噬细胞分泌产生大量的IL-6、IL-8等细胞因子并诱导其聚集，导致血清中的IL-6、IL-8含量显著增高[8]。

本实验研究结果显示，大柴胡汤能显著降低心肌组织中TNF-α和IL-6等炎症因子表达水平，具有调节高脂血症大鼠血脂的作用，并能改善高脂血症低度炎症状态。模型组TNF-α、IL-6蛋白的表达明显高于正常对照组，再一次证实高脂高胆固醇后刺激机体产生大量TNF-α、IL-6等细胞因子，增强高血脂对心肌的损害。采用大柴胡汤治疗后，测得TNF-α、IL-6相对于模型组显著降低，提示其对于高脂高胆固醇疾病有一定的防治作用，作用机制可能是抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的释放，防止因其过度释放聚集而对心肌组织造成损害，进而保护机体心脑肾重要脏器。尽早用药治疗对于降低心肌组织中炎性细胞因子含量水平、高脂高胆固醇疾病的预后和转归具有十分重要的临床意义。

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(本文编辑：李志文)

Dachaihu Decoction on high fat and high cholesterol in rats TNF-α，IL-6 expression level influence

CHANGYi-chuan，WANGFeng-rong.

GraduateSchoolofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，110032Shenyang，China

Objective Da-chai-hu-tang by studying the impact of high fat and cholesterol in the rat model of myocardial tissue and tumor necrosis factor α(TNF-α)，interleukin-6(IL-6)protein expression，and further clarify the treatment of high fat Dachaihutang cholesterol mechanisms of disease.Methods 45 young Wistar rats were randomly divided into normal control group，model group，Dachaihutang 3 groups. Establish control group，given a normal diet and daily normal saline; hyperlipidemia model groups of rats fed with high fat diet modeling; continuous 10 d; experimental section 11 d，Dachaihutang groups according to the amount of drug-containing crude drug Health and medicine about 0.3 g/mL intervention. Daily living conditions observed in rats，respectively，after modeling 10，20，30 d，measuring weight and statistics. Experimental Section 30 d，within each group to detect the expression of myocardial tissue TNF-α，IL-6 protein was detected by immunohistochemistry.Results Compared with the normal group，model group within hypercholesterolemic myocardium TNF-α，IL-6 protein expression were significantly increased(P<0.05). Compared with the model group，within Dachaihutang myocardial tissue TNF-α，IL-6 protein expression was significantly decreased(P<0.05). Conclusion The high-fat high-cholesterol in the body to stimulate TNF-α，IL-6 massive release of cytokines，Dachaihutang can better inhibit TNF-α IL-6 protein expression of high fat and cholesterol have a certain disease control effect.

High cholesterol; IL-6; TNF-α; Dachaihu Decoction; animal experiments； rat

110032 沈阳，辽宁中医药大学研究生学院(常一川)；辽宁中医药大学附属医院心内科(王凤荣)

常一川(1987-)，男，辽宁中医药大学2012级硕士研究生在读。研究方向：中医药防治心系疾病。

王凤荣，110032 沈阳，辽宁中医药大学附属医院心内科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.01.007

R-33

B

1674-3865(2015)01-0017-03

2014-12-09)