骨膜来源细胞在骨组织工程应用中的研究进展

李 婧

综 述

骨膜来源细胞在骨组织工程应用中的研究进展

李 婧

骨膜来源细胞； 骨组织工程； 成骨作用； 血管形成； 拟生态骨膜

创伤、骨变性疾病、肿瘤等导致骨组织的损伤是矫形外科面临的主要难题。自体骨、异体骨和基于可降解生物材料的人工骨，是近几十年来治疗骨缺损的主要方法。但存在各自的缺点和局限性，包括自体骨来源有限和供体区存在坏死风险，异体骨存在潜在感染性和免疫原性及人工骨替代物缺乏成骨潜力等。目前，自体骨移植仍是治疗不愈合骨缺损的金标准，而骨组织工程(bone tissue engineering)作为替代方法正成为研究热点。该方法所需自体组织量少，侵袭性小，比传统方法更安全。骨组织工程主要目的是将种子细胞接种在可降解生物载体上，修复受损或不健全的骨组织，并寻找克服自体组织移植缺陷的方法，种子细胞的选择和功能改进是其中重要方面[1-3]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是组织工程应用最多的种子细胞，具有高度自我更新和分化成不同细胞系的能力，来源广泛。但不同来源的MSCs存在表型异质性，尤其是移植后在移植区域产生不同体内结果和/或特异功能，因此，正确选择MSCs来源对受损组织再生得到更有效治疗十分重要[4]。骨髓来源MSCs是研究骨组织工程常用细胞，但从骨髓中分离MSCs存在潜在的风险和难度。近年来，从骨膜组织中分离培养骨膜来源细胞(periosteum derived cells, PDCs)用于骨组织工程正逐渐兴起[5-7]。临床实践表明，骨膜损伤将延迟骨愈合或导致不愈合，原因在于骨膜中存在大量具有MSCs表型特征的细胞群，其增殖分化潜力与骨髓来源MSCs相当或更佳，在骨损伤修复中发挥重要作用[8]。许多动物实验也已证明了PDCs具有修复骨缺损的能力[2,9-12]。从解剖学角度，骨膜与骨形成和修复更近，可能是更相关的细胞来源；从临床应用角度，小块骨膜组织中获取PDCs侵袭性更小，更安全。因此，以PDCs作为种子细胞修复骨缺损将是更佳策略。笔者现就近年来PDCs在骨组织工程中的应用研究进行综述。

1 骨膜及骨膜来源细胞分离培养

骨膜是被覆在除关节以外的骨表面上坚固的含有微血管的结缔组织包膜，由外部的纤维层(fibrous layer)和内部的形成层(cambium layer)组成。纤维层主要由具有高度组织性和方向性的胶原纤维组成，富含血管、神经，有营养和感觉作用，沿纵向随着骨生长扩展；形成层较薄，是MSCs、成骨细胞(osteoblasts)、成纤维细胞(fibroblasts)和周皮细胞(pericytes)等的聚集地，在骨生长过程中沿着逐渐增加骨周长和长度的方向扩展。骨膜通过Sharpey氏纤维牢固地锚定在位于其下部的骨上。应用专业手术器械可以较容易地从手术部位获得骨膜组织，例如在关节置换术中从股骨头中获得骨膜组织[13]。但应注意的是，不同部位来源的骨膜成骨能力存在差异[14]，例如胫骨骨膜比颅盖骨骨膜成骨能力更强[15]。新鲜的骨膜组织经液氮冻存2年后仍可用于分离PDCs，方便储存备用[16]。

目前，从骨膜中分离培养PDCs，主要有组织块培养法和酶消化法。组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的原代培养方法，优点是细胞从天然环境中迁出，能保证细胞的生理状态，避免PDCs受到外界因素的影响。缺点是耗时较长，且反复剪切和接种过程可能会对组织造成损伤，不能保证每个组织块都能长出细胞。酶消化法使用胶原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶等，将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代谢产物，可以短时间内得到大量活细胞并生长成片。但步骤繁琐，易污染，同时消化酶对细胞有一定损伤作用，需要摸索消化条件，且消化酶价格昂贵，实验成本高。尽管两种方法各有优缺点，但是方法学的差异不会影响所分离的PDCs的增殖能力和多能性，除了在细胞表面标志物表达上有些许差异[17]。

成功的器官组织工程，不能缺少支持细胞增殖和分化的适宜培养条件。培养基成分会影响细胞增殖和存活，调节细胞的生物学行为。文献报道，高糖或低糖DMEM、RPMI1640、DMEM/F12、α-MEM都可以用于PDCs的体外培养，但使用最多的当属α-MEM培养基。该培养基特点是容易使细胞贴壁生长，若适当添加某些营养成分，如加入谷氨酰胺或用D-缬氨酸代替L-缬氨酸，可以改善不同物种PDCs的生长状况[16,18-19]。胎牛血清是细胞体外培养的必要成分，但将PDCs应用于转化医学时，还要考虑动物血清替代物问题，既要保留PDCs表型特征，又要减少免疫原性[15,20]。

常规细胞培养多为二维培养系统，对于具有自我更新和分化能力的MSCs来说细胞增殖可获得的表面积有限，且在长期培养过程中存在失去分化能力的可能性。利用三维细胞培养系统可以改善这种状况。有研究显示，PDCs在旋转式三维培养平台中的扩增成球形，并保持存活性和增殖能力，标志性基因和蛋白的表达水平要高于二维培养，这对于提高PDCs的临床应用潜力大有裨益[21]。

2 骨膜来源细胞体外培养特点

骨膜中含有多种细胞类型，具有自我更新能力。在机械和生化等各种局部因素作用下分化产生成骨细胞和软骨细胞，参与软骨内成骨和膜内成骨[22-23]。体外培养的PDCs在不同诱导介质存在下，能向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，并且具备体内成骨潜力。这归因于PDCs中包含功能不同的祖细胞或多能性的原始干细胞，当受到周围组织或结构信号刺激后可以被活化。多能性可能是储存在成人骨膜中通常处于静息状态的细胞固有特性。正如胚胎期软骨膜(骨化后称为骨膜)为发育中骨骼的生长提供多能性细胞一样，成人骨膜中也存在未分化的多能MSCs，参与骨生理性生长和重塑。这为基于细胞的组织工程技术提供了丰富的细胞来源[19,24-25]。

体外培养的PDCs光镜下多数呈现成纤维细胞样形态特点，与MSCs类似，但不同物种来源的PDCs形态有所差异。PDCs具备MSCs的特征，应用MSCs表面标志物可以鉴定和分选PDCs[24]。在骨组织工程中，可以从骨膜中分选出较纯的MSCs，也可以直接用从骨膜组织分离培养的混合细胞群进行修复骨缺损。Arnsdorf等[25]证明，PDCs的异质性群体与NIH3T3成纤维细胞以相似的潜力表达成骨细胞样和脂肪细胞样标志物，从而认为骨膜内成纤维细胞可能也具有祖细胞样潜力，在组织多系分化中发挥作用；体外培养扩增的原代PDCs可以作为组织工程应用来源，不需要广泛的富集或分子标志分选。笔者认同此观点，因为PDCs存在异质性，目前尚不清楚骨形成、血管生成、招募成骨细胞、支持血管这些功能是由单一细胞类型完成，还是由特定亚群协同完成。PDCs应是一个有机整体，其中的各种组分可能相互协调，相互促进，细胞分选可能会远离骨膜组织本身在骨再生和修复中的天然作用。

种子细胞体外扩增能力是临床应用时必须考虑的一个重要问题。实验证明，PDCs在体外培养条件下保持快速增殖能力，没有接触抑制现象，能连续传数代仍保留分化潜能。PDCs增殖速度显著快于骨髓MSCs，在未来应用中可以缩短培养周期，降低消耗和污染的可能性。PDCs具有长的端粒，传代30代后也不会出现衰老现象。从老年患者分离的PDCs，仍具有高增殖潜力和分化能力。相反，骨髓MSCs随供体年龄增加，寿命缩短，呈现端粒缩短和衰老现象，且骨髓MSCs数量和分化潜力也随年龄降低。由于相当多老年患者需要矫形外科手术，因此，PDCs的增殖特点，使其在再生治疗的潜力更大。

3 生长因子调节骨膜来源细胞分化能力

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMPs)是一组多功能生长因子，在骨骼发育、修复和再生的早期阶段，招募局部祖细胞进入骨膜和内膜并决定其分化方向，参与所有物种的骨和软骨发育。独特的骨再生能力使其成为用于骨组织修复和再生的诱导因子。Wang等[26]证明，在愈合初期删除BMP-2基因将导致骨膜介导的骨痂形成消失，说明内源性表达的BMP-2对修复过程中PDCs的成骨和成软骨分化相当重要；而外源导入的BMP-2能以剂量依赖方式增强PDCs的成骨分化能力。

利用基因工程技术遗传修饰PDCs，外源性导入生长因子是改进其功能的重要方法。Sun等[2]利用复制缺陷型腺病毒转运BMP-2对来自兔的PDCs进行遗传修饰，并用于修复兔下颌骨缺损。结果表明，PDCs是基因转运的优秀靶细胞，易被腺病毒载体转导。基因修饰后的PDCs不仅保持较高的增殖能力，而且处于更强的分化状态。此外，基因修饰的PDCs能通过分泌生长因子诱导其他未分化干细胞或受体部位细胞分化和骨形成。Samee等[27]联合转染BMP-2和血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor, VEGF)，增强了PDCs成骨分化和骨形成能力。其原因之一是骨形成需要内皮细胞和成骨细胞的协同作用，这一过程被多种生长因子和细胞因子介导。BMPs与血管生成相关生长因子协同作用能进一步刺激骨形成[28-29]。研究表明，PDCs能表达VEGF及其受体，VEGF可以作为一种自分泌生长因子，用于PDCs的成骨分化。PDCs上的VEGF受体与血管形成无关，只促进成骨作用[4,30-31]。

此外，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)能在骨再生的早期阶段，增强PDCs的分裂增殖活性，从而增加分裂期PDCs的数量[32]。激活PDCs中Hedgehog (Hh) 信号通路，可以通过增强供体细胞的存活、分化和新生血管化改进骨缺损的重建[33]。

4 骨膜来源细胞具有致血管生成潜力

血管生成(vascularization)在骨发育和骨折修复中有重要作用。临床实践表明，缺乏活细胞的异体移植物与宿主骨的整合(osseointegration)缓慢而有限。移植部位血管系统的血液供应对维持成骨细胞的存活并促进移植物愈合和融入是必要的。有研究显示，在皮下骨移植模型中新鲜异体移植物比冻存异体移植物对来自宿主的血管形成应答大5～10倍，证明了血管生成和成骨之间的相互作用在骨再生和修复中的重要性。骨膜是高度血管化组织，能为骨和骨骼肌提供血液供应，其中的PDCs必定在血管生成中扮演重要角色。van Gastel等[34]首次描述了小鼠PDCs的致血管生成性质。当接种有PDCs的磷酸钙支架植入小鼠皮下后，PDCs能显著吸引新生血管进入支架材料。而且，PDCs与内皮细胞联合接种时，在体内形成的新生血管数要高于每种细胞单独接种形成的血管数量。表明PDCs的存在增强了宿主的血管形成应答：一方面，PDCs能表达并分泌血管生长因子VEGF，增强内皮细胞的增殖和存活[30]；另一方面，PDCs可以通过与内皮细胞形成血管网络，获得周皮细胞样表型，从而在结构上促进新生血管化。这也为组织工程构建血管化人工骨提供一种新思路。骨组织工程选择的细胞来源不仅要考虑成骨性质，而且也要关注致血管生成潜力，因此，PDCs的优势特征使其成为骨再生治疗的理想细胞来源。

5 基于骨膜来源细胞构建拟生态骨膜

临床实践已证明，保留骨膜的完整性能显著提高骨移植物的融合和重塑。基于当前干细胞生物学、基因治疗和生物材料装配方面的研究进展，有学者提出应用组织工程原理，制备模拟天然骨膜结构和功能的骨膜替代物，覆盖并活化任何大小或形状的异体骨或骨替代物，增强其骨修复和再生能力。人们已开始尝试构建这种基于细胞的拟生态骨膜(biomimetic periosteum)，来弥补骨组织工程修复骨缺损中骨膜缺失的不足。

了解细胞自我组装和表型调节的机制是模拟天然组织从头合成的基础。Evans等[35]利用固体支持脂双层(solid supported lipid bilayer, SLB)膜系统，从细胞之间的连接作用角度阐述了人PDCs引导组织形成(de novo tissue generation)的机制他们用重组的细胞黏附蛋白N-cadherin使SLB功能化后，高密度接种PDCs后，与接种在玻璃片上的PDCs进行瞬时表型和基因型差异比较。结果显示，N-cadherin功能化的SLB促进PDCs聚集，但不伴随PDCs中N-cadherin转录水平显著改变。相反，接种在非功能化SLB上的细胞不贴壁，但PDCs中N-cadherin转录显著上调。MSCs聚集是骨形成关键步骤。N-cadherin是MSCs聚集的标志，敲除N-cadherin将扰乱MSCs聚集和软骨形成。本研究表明，PDCs表达N-cadherin，为软骨内和膜内成骨提供分子基础，因此,在构建拟生态骨膜时首先要考虑细胞外基质在PDCs成骨分化中的作用。

失活的异体移植物是目前修复大段骨缺损广泛使用的材料，但存在较高的移植后10年骨折发生率。异体移植物愈合比自体移植物差，部分归因于缺乏骨膜调控的重塑。Hoffman和Benoit[36]提出,用含有可调节且可降解的聚乙二醇水凝胶制备组织工程化“拟生态骨膜”覆盖异体移植物，从而使其更适于细胞接种，更好地模拟自体移植物愈合期间细胞密度和持久性。通过显微CT、力学实验和组织学分析，证明了这种组织工程化骨膜替代物能使小鼠股骨缺损的愈合效果更佳。此外，还可从细胞密度、水凝胶组成和遗传修饰等方面改进组织工程化骨膜的特性，启动种子细胞和/或宿主-材料之间的相互作用，进一步改进异体移植物修复效果，减少或消除与异体移植物失败相关的修复手术。

总之，骨膜组织相对容易获得，PDCs能进行体外分离培养，并保持比骨髓MSCs更快的增殖能力，具备MSCs表型特征，在适当的体外诱导条件下能向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，其增殖和分化能力不受年龄因素影响。这些特点使PDCs必然会成为骨组织工程研究中种子细胞的选择热点。动物试验也已证明，PDCs在组织工程修复临界大小骨缺损中的潜力。在未来，应从遗传学、细胞生物学、材料学等方面充分开发PDCs在骨修复重塑中的功能，使其在基于细胞治疗的骨组织工程中发挥更大作用。

[1] Lee JH, Kim JH, Oh SH, et al. Tissue-engineered bone formation using periosteal-derived cells and polydioxanone/pluronic F127 scaffold with pre-seeded adipose tissue-derived CD146 positive endothelial-like cells[J]. Biomaterials, 2011,32(22):5033-5045.

[2] Sun M, Tan W, Wang K, et al. Effect of allogenous periosteal-derived cells transfected with adenovirus-mediated BMP-2 on repairing defects of the mandilble in rabbits [J]. J Oral Maxillofac Surg, 2013,71(10):1789-1799.

[3] Castro-Silva Ⅱ, Zambuzzi WF, de Oliveira Castro L, et al. Periosteal-derived cells for bone bioengineering: a promising candidate[J]. Clin Oral Implants Res, 2012,23(10):1238-1242.

[4] Ferretti C, Borsari V, Falconi M, et al. Human periosteum-derived stem cells for tissue engineering application: the role of VEGF[J]. Stem Cell Rev, 2012,8(3):882-890.

[5] Robert SJ, van Gastel N, Carmeliet G, et al. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath[J]. Bone, 2015,70:10-18.

[6] Ferretti C, Mattioli-Belmonte M. Periosteum derived stem cells for regenerative medicine proposals: Boosting current knowledge[J]. World J Stem Cells, 2014,6(3):266-277.

[7] Rosales-Rocabado JM, Kaku M, Kitami M, et al. Osteoblastic differentiation and mineralization ability of periosteum-derived cells compared with bone marrow and calvaria-derived cells[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2014,72(4):694.

[8] Filion TM, Song J. A sulfated nanofibrous mesh supporting the osteogenic differentiation of periosteum-derived cells[J]. J Biomater Tissue Eng, 2013,3(4):486-493.

[9] Colnot C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration[J]. J Bone Miner Res, 2009,24(2):274-282.

[10] Haberstroh K, Ritter K, Kuschnierz J, et al. Bone repair by cell-seeded 3D-bioplotted composite scaffolds made of collagen treated tricalciumphosphate or tricalciumphosphate-chitosan-collagen hydrogel or PLGA in ovine critical-sized calvarial defects[J]. J Bionmed Mater Res B Appl Biomater, 2010,93(2):520-530.

[11] Thitiset T, Damrongqsakkul S, Bunaprasert T, et al. Development of collagen/demineralized bone powder scaffolds and periosteum-derived cells for bone tissue engineering application[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(1):2056-2071.

[12] Zhang X, Xie C, Lin AS, et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering[J]. J Bone Miner Res, 2005,20:2124-2137.

[13] Knothe Tate ML, Chang H, Moore SR, et al. Surgical membranes as directional delivery devices to generate tissue: testing in an ovine critical sized defect model[J]. PloS One, 2011,6(12):e28702.

[14] Ichikawa Y, Watahiki J, Nampo T, et al. Differences in the developmental origins of the periosteum may influence bone healing[J]. J Periodontal Res, 2014,[Epub ahead of print].

[15] Alexander D, Rieger M, Klein C, et al. Selection of osteoprogenitors from the jaw periosteum by a specific animal-free culture medium[J]. PloS One, 2013,8(12): e81674.

[16] McDuffee LA. Comparison of isolation and expansion techniques for equine osteogenic progenitor cells from periosteal tissue[J]. Can J Vet Res, 2012,76(2):91-98.

[17] Chang H, Docheva D, Knothe UR, et al. Arthritic periosteal tissue from joint replacement surgery: a novel, autologous source of stem cells[J]. Stem Cells Transl Med, 2014,3(3):308-317.

[18] Wu X, Lin M, Li Y, et al. Effect of DMEM and RPMI1640 on the biological behavior of dog periosteum-derived cells[J]. Cytotechnology, 2009,59(2):103-111.

[19] Kisiel AH, McDuffee LA, Masaoud E, et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and peristeum[J]. Am J Vet Res, 2012,73(8):1305-1317.

[20] Roberts SJ, Owen HC, Tam WL, et al. Humanized culture of periosteal progenitors in allogeneic serum enhances osteogenic differentiation and in vivo bone formation[J]. Stem Cells Transl Med, 2014,3(2):218-228.

[21] Cha HM, Kim SM, Choi YS, et al. Scaffold-free three-dimensional culture systems for mass production of periosteum-derived progenitor cells[J]. J Biosci Bioeng, 2015 Jan 29.

[22] Murao H, Yamamoto K, Matsuda S, et al. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture[J]. J Bone Miner Metab, 2013,31(4):390-398.

[23] Ito R, Matsumiya T, Kon T, et al. Periosteum-derived cells respond to mechanical stretch and activate Wnt and BMP signaling pathways[J]. Biomed Res, 2014,35(1):69-79.

[24] Chang H, Knothe Tate ML. Concise review: the periosteum: tapping into a reservoir of clinically useful progenitor cells[J]. Stem Cells Transl Med, 2012,1(6):480-491.

[25] Arnsdorf EJ, Jones LM, Carter DR, et al. The periosteum as a cellular source for functional tissue engineering[J]. Tissue Eng Part A, 2009,15(9):2637-2642.

[26] Wang Q, Huang C, Xue M, et al. Expression of endogenous BMP-2 in periosteal progenitor cells is essential for bone healing [J]. Bone, 2011,48(3):524-532.

[27] Samee M, Kasugai S, Kondo H, et al. Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) transfection to human periosteal cells enhances osteoblast differentiation and bone formation[J]. J Pharmacol Sci, 2008,108(1):18-31.

[28] Sharma A, Meyer F, Hyvonen M, et al. Osteoinduction by combining bone morphogenetic protein (BMP)-2 with a bioactive novel nanocomposite[J]. Bone Joint Res, 2012,1(7):145-151.

[29] Lo KW, Ulery BD, Ashe KM, et al. Studies of bone morphogenetic protein-based surgical repair[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2012,64(12):1277-1291.

[30] Hah YS, Jun JS, Lee SG, et al. Vascular endothelial growth factor stimulates osteoblastic differentiation of cultured human periosteal-derived cells expressing vascular endothelial growth factor receptors[J]. Mol Biol Rep, 2011,38(2):1443-1450.

[31] Park BW, Hah YS, Kim DR, et al. Vascular endothelial growth factor expression in cultured periosteal-derived cells[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2008,105(5):554-560.

[32] Gruber R, Karreth F, Frommlet F, et al. Platelets are mitogenic for periosteum-derived cells[J]. J Orthop Res, 2003,21(5):941-948.

[33] Huang C, Tang M, Yehling E, et al. Overexpressing sonic hedgehog peptide restores periosteal bone formation in a murine bone allograft transplantation model[J]. Mol Ther, 2014,22(2):430-439.

[34] van Gastel N, Torrekens S, Roberts SJ, et al. Engineering vascularized bone: osteogenic and proagiogenic potential of murine perioteal cells[J]. Stem Cells, 2012,30(11):2460-2471.

[35] Evans SF, Docheva D, Bernecker A, et al. Solid-supported lipid bilayers to drive stem cell fate and tissue architecture using periosteum derived progenitor cells[J]. Biomaterial, 2013,34(8):1878-1887.

[36] Hoffman MD, Benoit DS. Emerging ideas: engineering the periosteum: revitalizing allografts by mimicking autograft healing [J]. Clin Orthop Relat Res, 2013,471(3): 721-726.

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261021 山东 潍坊，中国人民解放军第八十九医院 骨科实验室

李 婧(1974-)，女，辽宁兴城人，副主任技师，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.08.016

2015-04-12)