毛囊干细胞的分离培养及鉴定

肖锋综述，谭军审校

（1.湖南师范大学第一附属医院整形激光美容外科湖南长沙410000；2.湖南省人民医院整形激光美容外科湖南长沙410000）

毛囊干细胞的分离培养及鉴定

肖锋1综述，谭军2审校

（1.湖南师范大学第一附属医院整形激光美容外科湖南长沙410000；2.湖南省人民医院整形激光美容外科湖南长沙410000）

毛囊干细胞是皮肤组织工程理想的种子细胞，已成为近年来的研究热点之一。分离培养及鉴定是其研究的基础手段，作者将近年来毛囊干细胞几种常用的分离培养及鉴定方法进行较为系统的分析、总结和归纳，为毛囊干细胞的深入研究提供坚实的基础。

毛囊干细胞；鉴定；分离培养

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，存在于胚胎及成体内。在一定条件下，干细胞可以无限增殖而保持未分化状态，也可以分化成多种功能细胞。20世纪，Cotsarel is、Taylor等［1］通过相关研究发现，在毛囊上部由外根鞘形成的明显突起，即隆突区域也有干细胞的存在，这些干细胞被定义为毛囊干细胞。毛囊干细胞与其他成体干细胞一样拥有强大的增殖能力及多向分化潜能［2］。毛囊干细胞能通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞；毛囊干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迁移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪［3-4］。近年来，毛囊干细胞的研究备受关注，已成为研究热点之一。目前，存在多种毛囊干细胞的分离培养及鉴定方法，为毛囊干细胞的深入研究提供了坚实的基础，作者就毛囊干细胞常用的分离培养及鉴定作一简要综述。

1　毛囊干细胞的分离纯化

此前，已有许多研究者采用不同的方法来分离毛囊干细胞，并成功地进行传代培养，进行后续更深入的研究。目前对毛囊干细胞分离纯化常用的有以下几种方法：

1.1组织块培养法

取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用PBS液冲洗，将皮肤切成小块，表皮朝上贴于加入适量培养基的培养器皿中，置于5%CO2培养箱中，37℃，饱和湿度条件下培养。组织块培养法分离的干细胞能持续保持增殖趋势，没有明显的平台期，并且随着不断传代纯化，此方法获得的毛囊干细胞纯度明显增加。但是组织块培养法分离获取毛囊干细胞的效率较低。史明艳等［5］使用该方法成功获得毛囊干细胞，并分析指出该方法的优势在于组织块培养时从组织块中迁移出来其他细胞为毛囊干细胞创造了一个类似于体内的微环境，使毛囊干细胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2显微分离技术

取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高浓度青、链霉素的PBS液反复冲洗3次；在超净工作台内，显微镜下显微镊钝性分离单个毛囊组织，收集形态完好且处于生长期的毛囊。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入含培养基培养皿，于37℃、5%CO2孵箱中培养。显微分离技术能从样本直接选取毛囊干细胞相对富集区域，有利于后续进一步的纯化［6］。王祝迁等［7］使用此方法成功分离出大鼠毛囊干细胞，但单纯应用显微分离技术获取高纯度的毛囊干细胞需花费大量的时间和精力，效率偏低。

1.3酶消化法

取含有待培养毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用含双抗PBS液冲洗，将皮肤样本剪成小块，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃摇床消化2h。取出组织用PBS冲洗3遍，置于胰蛋白酶（质量浓度为2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃摇床消化1h后，过200目钢网。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入细胞培养液培养。此方法获得的毛囊干细胞克隆形成能力强，获取效率高。郑宣等［8］用此法获得较纯的毛囊干细胞，但获得的毛囊干细胞经历增殖期后生长速度逐渐减慢，且细胞存活率下降，可能与酶消化法破坏了毛囊干细胞生长微环境有关。

1.4差数贴壁法

将收集的细胞接种于Ⅳ型胶原包被的培养皿中，静置20min后，收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中，贴附皿底的毛囊干细胞，置于体积分数为5%CO2、37℃孵箱中培养，每3d换液一次。与单纯使用某种毛囊干细胞分离方法相比较，联合差数贴壁法将更进一步纯化，获得纯度更高的毛囊干细胞。彭彧等［9］使用酶消化法联合差数贴壁法获得了形态典型且均匀一致的毛囊干细胞。目前此方法已被广泛使用。

1.5免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用来纯化分离培养获得的毛囊隆突区细胞中某种标记物阳性的细胞。首先制作细胞悬液，并加入FITC标记的某种标记物单抗，室温孵育30min，离心后弃上清中未结合的抗体，加入磁珠分选缓冲液重悬细胞，再次离心后弃上清，PBS缓冲液清洗2次，取重悬后细胞与免疫磁珠混合，室温反应30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用磁珠分选缓冲液洗5次。体积分数为5%CO2、37℃孵箱培养48h，使细胞与磁珠分离，即可获得较纯的毛囊干细胞。谭挺等［10］用此法获得高纯度毛囊干细胞，他们指出此方法与显微分离技术连用有单次操作分离细胞数量大且纯度较高、能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容等特点。黄恩毅等［11］用此法有效分离并成功培养CD34+毛囊干细胞，发现分选后的细胞仍具有较好的活性，且增殖速度快，增殖期长。卢葳等［6］通过实验证实，免疫磁珠分选后毛囊干细胞活力较好，分离获得的毛囊干细胞适合用于细胞培养、诱导等后续试验。

1.6流式细胞仪分选法

通过毛囊干细胞表达的某些特异性标记物，利用流式细胞仪可以将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得较高纯度的特异性细胞。常用的是荧光激活细胞分选器。卢葳等［6］使用流式细胞仪分选CD34+毛囊干细胞，获得的毛囊干细胞纯度很高、污染机会小，但是分选过程费时，细胞分选后活力稍差。此方法适合于需要做免疫组化，蛋白质组织学等对细胞纯度要求高的实验。

2　毛囊干细胞的鉴定

干细胞的鉴定一直是干细胞研究的难点，常用干细胞的标记物辅助方法进行鉴定。毛囊干细胞有多种明确的分子标记物，如CD34、K15、K19［12］。

2.1角蛋白家族

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。在表皮细胞中，它们以微丝的状态在细胞内形成广泛的网状结构。在上皮组织中有20多种不同种类的角蛋白表达。在表皮细胞中，随着分化程度的不同其所表达的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作为毛囊干细胞的鉴定手段。1998年，lyle等［13］通过表达克隆发现K15是毛囊干细胞表面标记之一，此后K15一直被当做较为公认的毛囊干细胞标记物。20世纪末，有研究者通过实验发现滞留细胞所在的毛囊隆突部细强表达K19［14］；同时有实验发现毛囊隆突部K19高表达细胞缺乏特异性分化标志，进一步证实K19高表达细胞为毛囊干细胞，因此，认为K19也可作为毛囊干细胞表面标记物［15］。在毛囊干细胞分化过程中，K15表达减弱较K19早，K19表达阳性而K15阴性的细胞仍有可能为处于早期阶段的增殖细胞，因此推测，检测毛囊干细胞时K15更准确［13］。

2.2钙黏蛋白家族

钙黏蛋白是一种同亲型结合、Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。不同细胞及发育不同阶段其细胞表面的钙黏蛋白的种类与数量均有所不同，目前已经发现几十种钙黏蛋白。CD34抗原是钙黏蛋白中的一种，是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，为阶段特异性白细胞分化抗原，CD34表达于人类造血干细胞，CD34是目前公认的造血干细胞标志物。Ohyama等［16］通过对鼠毛囊的研究，发现鼠毛囊中CD34阳性细胞与毛囊隆突部滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干细胞标记物。Trempus等［17］通过动物实验首次证实了CD34表达于小鼠毛囊干细胞。但CD34在人毛囊干细胞不表达，Shu Jiang等［18］通过对人头皮进行原位免疫组化和多色免疫荧光标记，发现CD34特异性表达于毛囊间表皮基底部。

2.3整合素家族

整合素是机体重要的黏附分子，是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞跨膜蛋白，在细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间起黏附作用，整合素是由α和β两个亚单位组成的异源二聚体，它们按不同的组合构成20余种整合素。目前，整合素也被广泛用于毛囊干细胞的鉴定，常用的整合素为整合素β1。1995年，Jones等［19］根据表皮细胞表达整合素β1的水平将其进行分组培养，结果发现整合素β1高表达的表皮细胞比低表达者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Wat t等［20］发现，富含整合素β1的皮肤基底细胞比整合素β1含量少的皮肤基底细胞能更快速的黏附细胞外基质蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述发现均为整合素β1作为毛囊干细胞特异性表面标记物提供有力支持。

3　结论

综上，目前常用的分离培养方法主要包括：组织块培养法、显微分离技术、酶消化法、差数贴壁法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法，每种方法均有各自的优势及缺陷；组织块培养法简单，但是分离纯度不高，分离效率低下；显微分离技术相对其他方法而言，分离纯度高，但是分离过程比较费时费力；酶消化法效率高，但是酶消化过程同时会破坏细胞微环境，影响细胞存活率；差数贴壁法一般联合其他分离纯化方法，能进一步纯化所获毛囊干细胞；免疫磁珠法获得的毛囊干细胞纯度高、活性强，但是分离方法较复杂；流式细胞仪分选法所获得毛囊干细胞纯度高，但细胞活性低。因此，在选择毛囊干细胞分离培养方法时一定要根据实验的特殊要求及实验条件选择合适的方法。毛囊干细胞的鉴定方法常用的包括：角蛋白家族、钙黏蛋白家族、整合素家族；实验条件允许的情况下，同时检测两种以上的标记物来鉴定毛囊干细胞是较为准确的一种方法。

毛囊干细胞具有其他干细胞的共同特征，具有多向分化潜能。目前，已有实验证实毛囊干细胞能用于尿道缺损、神经损伤的修复；能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞［1，21-22］；能有效促进创面愈合，将其作为工程皮肤中的种子细胞，有利于表皮细胞及汗腺、毛囊等附属器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干细胞有利于瘢痕的修复，但该研究仍处于起步阶段，相信经过研究者们的不懈努力，其必将为瘢痕治疗这一世界性难题提供一种有效的新方法。

［1］赵奎，贾宗菲，弓慧敏，等.毛囊干细胞的分离方法及应用［J］.中国畜牧兽医，2010，37（12）：82-85.

［2］Wu JC，Yang TT，Xu X，et al.Research on differentiation of human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes invitro［J］.JMed Postgra，2010，23（2）：128-132.

［3］原璐，王春生，安铁洙，等.毛囊干细胞研究进展［J］.中国生物杂志，2009，29（1）：75-79.

［4］Jaks V，Barker N，Kasper M，et al.Igr5 marks cycling，yet long-lived，hair follicle stem cells［J］.Nat Genet，2008，40（11）：1291-1299.

［5］史明艳，杨学义，窦忠英.山羊毛囊干细胞分离培养方法研究［J］.畜牧兽医学报，2006，37（5）：436-440.

［6］卢葳，陈瑾，李惠.两种纯化大鼠毛囊干细胞方法的比较［J］.重庆医科大学学报，2010，35（1）：124-126.

［7］王祝迁，木拉提·热夏提，李佳，等.大鼠触须毛囊干细胞的分离培养和鉴定［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（27）：5031-5034.

［8］郑宣，许世超，全仁夫.大鼠毛囊干细胞的体外培养及相关检测的实验研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2014，22（2）：8-14.

［9］彭彧，王玉杰，李佳，等.不同体积分数富血小板血浆与大鼠毛囊干细胞的增殖［J］.中国组织工程研究，2012，16（45）：8501-8505.

［10］谭挺，胡志奇，周洪军.显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细胞［J］.中国修复重建外科杂志，2008，22（2）：202-205.

［11］黄恩毅，杨恬，陈伟，等.毛囊干细胞的纯化培养鉴定及其生物学特性［J］.第三军医大学学报，2008，30（1）：39-42.

［12］Tsai SY，Clavel C，Kim S，et al.Oct4 and k lf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells［J］. Stem Cells，2010，28（2）：221-228.

［13］Lyle S，Christofidou-Solom idou M，Iiu Y，etal.The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the 10-8 cation of human hair follicle stem cells［J］. JCell Sci，1998，111：3179-3188.

［14］M ichel M，Torok N，Godbout M J，et al.Keratin 19 as a biochemicalmarker of skin stem cells in vivo and in vitro：keratin 19 expressing cells are differentially 10 calized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage［J］.JCell Sci，1996，109：1017-1028.

［15］Reynolds AJ，Jahoda CA.Hair follicle stem cells A distinct germ inative epidermal cell population is active in vitro by the presenceof hair dermal papillar cells［J］.JCell Sci，1991，99：373-385.

［16］Ohyama M，Terunuma A，Tock CL，et al.Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells［J］.JClin Invest，2006，116（1）：249-260.

［17］Trempus CS，Morris RJ，Bortner CD，et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34［J］.J Invest Dermatol，2003，120（4）：501-511.

［18］Shu Jiang，Longmei Zhao，Bham ini Purandare，et al. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments［J］.Histochem Cell Biol，2010，133：455-465.

［19］Jones PH，Harper S，Watt FM.Stem cell patterning and fate in human epidermis［J］.Cell，1995，80（1）：83-93.

［20］Watt FM.Epidermal stem cells：markers，patterning and the controlof stem cell fate［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1998，353（1370）：831-837.

［21］蔡霞.人毛囊干细胞的分离培养鉴定与生物学特性的初步研究［J］.四川医学，2014，35（1）：1-3.

［22］彭文标，刘春晓，谢群，等.富集兔毛囊干细胞构建组织工程化尿道的研究［J］.上海交通大学学报，2013，33（3）：285-289.

编辑/李阳利

The cultivation and identification of hair follicle stem cells

XIAO Feng1，TAN Jun2
（Departmentof Plastic and Laser Aesthetic Surgery，Peop le's Hosp italofHunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）

Hair follic le stem cells are the ideal seed cells for skin tissue eng ineering，which has become a hot research top ic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author w ill analyze and summarize severalmethods o f isolation and culture o f hair follic le stem cells in recentyears.Itwillp rovide a solid foundation for the further study ofhair follic le stem ce lls.

hair follic le stem cells；identification；cultivation

R329.2

A

1008-6455（2015）19-0077-04

2015-07-07

2015-08-30