HBsAg对脂多糖诱导树突状细胞分泌IL-6和IL-12的影响

汤永志 燕飞 朱坚胜 陈华忠 朱敏 肖明 林希 邵辉

●基础研究

HBsAg对脂多糖诱导树突状细胞分泌IL-6和IL-12的影响

汤永志 燕飞 朱坚胜 陈华忠 朱敏 肖明 林希 邵辉

目的 研究HBsAg对脂多糖诱导树突状细胞（DCs）分泌IL-6和IL-12的影响。方法 采用重组人粒-单核集落刺激因子（rhGM-CSF）联合重组人白细胞介素4（rhIL-4）诱导单个核细胞得到未成熟树突状细胞（iDCs），分别加入HB-sAg1、2、5μg/ml，并设对照组，各组再加入脂多糖诱导为成熟DCs。采用流式细胞术鉴定各组iDCs的表型（CD11c、HLA-DR），ELISA法检测脂多糖诱导后培养上清液中IL-6和IL-12的水平。 结果 iDCs的CD11c/HLA-DR双阳性率为（83.62± 6.89）%，显著高于单纯培养组（20.57±11.19）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。HBsAg 1、2、5μg/ml组培养上清液中IL-6分别为（609.36±127.06）、（566.01±173.46）、（295.03±76.08）pg/ml，低于对照组（1356.97±181.78）pg/ml（均P＜0.05）；HBsAg 2、5μg/ml组IL-12分别为（854.49±67.92）、（472.09±55.70）pg/ml，低于对照组（1248.78±112.09）pg/ml（均P＜0.05）；1μg/ml组IL-12（1103.53±134.15）pg/ml，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 低浓度HBsAg可下调脂多糖诱导的DCs细胞因子分泌。

乙型肝炎表面抗原 树突状细胞 IL-6 IL-12

乙肝病毒感染慢性化机制复杂，目前认为乙肝病毒持续感染的主要机制是免疫耐受。树突状细胞（DCs）是最具潜力的专职抗原提呈细胞，在机体免疫应答中发挥重要作用，其功能主要取决于成熟状态，未成熟DCs（iDCs）倾向于诱导免疫耐受，成熟DCs则诱导免疫激活引发免疫排斥反应，IL-6和IL-12是免疫应答过程中T细胞活化、抗原提呈的重要细胞因子。笔者通过外周血来源单个核细胞经刺激因子诱导形成的DCs被不同浓度HBsAg干预的方式，研究HBsAg干预后DCs分泌IL-6和IL-12的水平，现将实验结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，人淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司，脂多糖购自美国Sigma-aldrich公司，rhGM-CSF、rhIL-4购自美国R&D公司，HBsAg购自以色列Prospec公司，抗人HLA-DR FITC、抗人CD11c-PE及同型对照购自美国Ebioscience公司，IL-12/IL-6 ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，新鲜外周血浓缩白细胞由浙江省台州市中心血站提供。

1.2 实验方法

1.2.1 DCs体外诱导与分组 新鲜外周血浓缩白细胞与PBS按比例稀释混匀，加至淋巴细胞分离液上层，2 500r/min离心30min，收集中间白膜层洗涤数次，加入无血清RPMI-1640重悬，置于37℃、5%CO2培养箱中，2h后收集贴壁细胞，一组加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基（单纯培养组），另一组加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基与rhGM-CSF（50ng/ml）、rhIL-4（30ng/ml）（GM-CSF+IL-4诱导组），置于培养箱中培养，隔天半量换液。第7天时将rhGM-CSF+rhIL-4诱导组的iDCs分设3组：HBsAg 1、2、5μg/ml组，并设单纯培养作对照组，第8天时加入脂多糖（1μg/ml）诱导24h获得成熟DCs。

1.2.2 细胞形态的观察与表型鉴定 收集培养7d后的悬浮细胞，分别在光学显微镜、电镜下观察细胞形态，采用流式细胞术鉴定iDCs表型：CD11c、HLA-DR。

1.2.3 细胞上清液IL-6/IL-12水平检测 第9天时收集各组细胞培养的上清液。按IL-6/IL-12 ELISA试剂盒操作，测定各样本A450值，绘制标准曲线，计算细胞因子水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，细胞表型组间比较采用Mann-Whitney U检验，Levene检验方差齐性，细胞因子水平以表述，组间比较采用One way ANOVA的LSD-t检验。

2 结果

2.1 诱导培养后的细胞形态特点 诱导培养7d后光镜下见细胞悬浮聚集，体积增大，形态不规则，表面可见较多树杈样突起。电镜下细胞表面粗糙，有较多突起，为典型DCs形态。

2.2 DCs诱导效果的比较 rhGM-CSF+rhIL-4诱导7d，悬浮细胞CD11c/HLA-DR双阳性率为（83.62±6.89）%，显著高于单纯培养组（20.57±11.19）%，差异有统计学意义（P＜0.05），与文献报道的单核细胞来源iDCs一致[1]，见图1。

2.3 不同HBsAg浓度组细胞因子水平的比较 见表1。

由表1可见，HBsAg 1μg/ml时，IL-12的水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），2、5μg/ml组均显著低于对照组（均P＜0.05）；IL-6水平随HBsAg浓度依次降低（均P＜0.05），1μg/ml组与2μg/ml组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 单纯培养组与rhGM-CSF+rhIL-4诱导组细胞双阳性率的比较。与单纯培养组比较，*P＜0.05

表1 不同HBsAg浓度组细胞因子水平的比较（pg/ml）

3 讨论

DCs是体内功能最强的抗原提呈细胞，在乙型肝炎病毒清除过程中发挥重要免疫作用。脂多糖是G－菌的细胞壁成分，被广泛应用于TLR4-MyD88信号通路的激活，导致下游基因转录合成多种细胞因子（如IL-12，IL-6，TNF等），启动Th1反应[2-3]。已有研究表明HBV抗原（主要为HBsAg）可影响浆样DCs功能表型，干扰其成熟过程以及TLR-9信号通路下游的细胞因子（IFN-α等）分泌[4-5]。HBsAg影响外周血单个核细胞TLR2/4 mRNA表达转录，新近研究发现HBsAg（25、50μg/ml）时通过NF-κB和p38通路明显上调单核来源DCs的IL-12分泌，对Th细胞免疫进行正向调节[6-7]；更有日本学者报道慢性乙肝患者注射经HBsAg负载的DCs后可出现抗HBs抗体[8]。由此，HBsAg通过DCs相关信号通路进行免疫调节，可望远期用于治疗临床慢性乙型肝炎。

本研究在脂多糖诱导单核来源DCs细胞因子分泌的过程中加入低浓度HBsAg，比较不同浓度HBsAg干预组与对照组IL-12/IL-6的分泌水平，结果发现HB－sAg在1μg/ml时IL-6分泌下降，而2μg/ml组和5μg/ml组IL-6水平下降更明显；HBsAg对IL-12的分泌也有下调作用，其中2μg/ml组、5μg/ml组较为明显。因此，HBsAg可通过TLR4-MyD88下游的信号通路干预DCs的细胞因子分泌。低浓度时HBsAg下调IL-6、IL-12等因子分泌，影响脂多糖诱导的DCs成熟，而HBsAg在25μg/ml以上浓度[6-7]时，相关信号通路激活，IL-12分泌上调，进而激活Th细胞免疫应答，发挥其免疫原性作用。

HBsAg较低浓度时影响DCs细胞因子分泌的确切分子机制尚需进一步研究证实。结合文献，较高浓度HBsAg通过调节Th细胞的免疫应答，活化DCs，激活抗原提呈过程，完成细胞对乙肝病毒的免疫应答。

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Effect of HBsAg on IL-6/IL-12 production of mononuclear-derived dendritic cells stimulated by lipopolysaccharide

TANG Yongzhi, YAN Fei,ZHU Jiansheng,et al.
Department of Infectious Diseases,Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Taizhou 317000,China

Objective To investigate the effect of HBsAg on IL-6/IL-12 production of dendritic cells(DCs)stimulated by Lipopolysaccharide(LPS). Methods Mononuclear cells were isolated and cultured in complete medium containing GM-CSF plus IL-4 to obtain immature DCs.Flow cytometry were performed to define the phenotypic characteristics of iDCs.Different concentrations(1,2 and 5μg/ml)of HBsAg were added in culture medium.The DCs were cultured for 24 h for maturation,followed by a 24h-differentiation culture with LPS (1μg/ml).The inflammatory cytokines from cell supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results The expression of CD11c and HLA-DR on immature DCs was(83.62± 6.89)%,compare to(20.57±11.19)%in control group.IL-6 production was significantly decreased with the treatment of HBsAg (1,2 and 5μg/ml,P＜0.05).IL-12 production demonstrates the similar results with the treatment of 2 and 5μg/ml HBsAg(P＜0.05),but no changes with the treatment of 1μg/ml HBsAg(P＞0.05). Conclusion HBsAg may down-regulate the secretion of cytokines in DCs stimulated by LPS at lower dosage.

HBsAg Dendritic cells Interleukin-6 Interleukin-12

2013-08-14）

（本文编辑：杨丽）

浙江省医药卫生科学研究基金计划项目（2010KYB125）

317000 台州，温州医科大学附属台州医院感染科（汤永志、燕飞、朱坚胜、陈华忠、林希、邵辉），公共科研平台（朱敏）；重庆医科大学病理教研室（肖明）

朱坚胜，E-mail：zhujs@tzhospital.com