人类半翼基因在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组织中的表达及其意义

沈鹏 谢永红 陈林龙

●检测诊断

人类半翼基因在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变组织中的表达及其意义

沈鹏 谢永红 陈林龙

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。目前临床宫颈癌早期筛选的检测标记物主要有人乳头状病毒脱氧核糖核苷酸（HPV-DNA）和pl6INK4a，但都存在一定的局限性[1-5]，因此选择新的生物标记物来提高宫颈癌筛查的敏感度和特异度迫在眉睫。已有研究表明，正常宫颈、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ）、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织中,人类半翼基因（hWAPL）阳性表达率呈逐渐升高趋势，hWAPL与宫颈癌发生、发展有着密切关系。为探索hWAPL基因表达在宫颈上皮内病变筛查中的作用，我们研究了各级宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中hWAPL的表达及其与宫颈细胞学结果之间的关系，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2010年1至10月海宁市妇幼保健院宫颈手术标本90例，患者年龄28～58（43.07±8.48）岁。病理学诊断：鳞癌（SCC）17例，CINⅢ26例，CINⅡ32例，CINⅠ11例，正常对照4例（为同期因良性疾病而行阴道镜检并同时行子宫切除的宫颈组织）。细胞学类型：高度鳞状上皮内病变（HSIL）34例，低度鳞状上皮内病变（LSIL）8例，意义不明确的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）15例，不排除高度病变的非典型鳞状上皮细胞（LASC-H）28例，无上皮内病变或恶性肿瘤细胞（NILM）5例。所有患者术前均未行放化疗，取材后立即用4%甲醛溶液（0.01mol/L PBS）固定12h，石蜡包埋备用。

1.2 主要试剂 兔抗人hWAPL多克隆抗体 (加拿大Novus公司产品)；免疫组化PV-9000试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司产品）。

1.3 免疫组化法检测hWAPL蛋白表达 组织块4%甲醛溶液固定后，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度5μm。60℃烤片15min后，常规方法脱蜡，0.01mol/L PBS振洗3次，每次3min；切片放入3%H2O2中，37℃孵育15min以灭活内源性过氧化物，0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。将切片浸入0.01M枸椽酸钠缓冲液中，微波炉加热至沸腾，冷却后0.01mol/L的PBS振洗3次，每次3min。山羊血清室温封闭切片5min后，0.01mol/L PBS振洗2次，加1∶100的一抗（兔抗人hWAPL多克隆抗体，阴性对照加0.01mol/L的PBS），于37℃在湿盒内孵育1h，然后置于4℃冰箱孵育过夜。切片滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，在37℃孵育20min，0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min。接着进行DAB显色：切片滴加1～2滴显色剂，染色15min，双蒸水冲洗终止反应。自来水充分冲洗，苏木素轻度复染细胞核（染色时间在1min以内）。切片依次行蒸馏水、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明。用中性树胶封片。阅片，拍照，病理图文定量分析。

1.4 结果判定标准 采用显色强度结合阳性细胞百分比法判读结果[1-2]。以细胞胞质或胞核内出现棕黄色颗粒计3分，出现黄色颗粒，计2分，出现淡黄色颗粒或无黄色颗粒出现，分别计1分或0分。hWAPL染色阳性细胞为细胞质内深棕色颗粒，以积分≥3分为阳性表达病例。高倍视野下计数上皮细胞与阳性细胞总数，计算阳性细胞率（阳性细胞率=阳性细胞数/上皮细胞总数×100%）：阳性细胞率为6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，≥76%为4分。以显色强度分值与阳性细胞率分值的乘积作为最后得分（染色强度）。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，测得计量资料采用表示，多组比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 90例标本中hWAPL蛋白的表达与细胞学类型之间的关系 见表1。

表1 90例标本中hWAPL蛋白的表达与细胞学类型之间的关系

由表1可见，HSIL、LSIL、ASCUS、ASC-H各组的表达强度均明显高于NILM组（P＜0.05）；在HSIL组明显高于LSIL组（P＜0.05）；在需要排他性诊断的ASCUS和ASC-H组表达强度也明显高于LSIL组（P＜0.05）；而ASCUS、ASC-H和HSIL组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 不同细胞学类型中hWAPL表达染色强度与宫颈组织学级别之间的关系 见表2。

表2 不同细胞学类型中hWAPL表达染色强度与宫颈组织学级别之间的关系

由表2可见，在ASCUS细胞类型中，SCC+CINⅢ组hWAPL染色强度明显大于CINⅡ+CINⅠ+慢性宫颈炎组（P＜0.05）。

3 讨论

我们前期研究证实hWAPL基因表达强度与组织学结果之间具有密切关系，该结果与国内外的研究结果一致[6-7]。Oikawa等[6]采用实时定量PCR技术对肿瘤及正常组织中的hWAPL基因的mRNA水平进行了检测，结果表明hWAPL在宫颈癌组织中的mRNA表达水平显著高于其在正常宫颈组织组以及子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肾癌和结肠癌的表达，提示hWAPL在宫颈癌组织中具有特异性高表达的特征。国内鲁笑钦等[7]应用免疫组化方法对27例正常宫颈、47例宫颈癌及238例其他8种癌组织的hWAPL基因的表达情况进行检测，实验发现，正常宫颈和宫颈癌组织中hWAPL基因阳性表达率分别为33.70%、97.87%。 hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌、肺癌中呈阴性表达；在膀胱癌和食管癌中，仅有部分样本呈弱阳性表达。因此，hWAPL表达强度反映了宫颈组织学病变的程度，显示了hWAPL作为一种新的生物标记物诊断宫颈疾病的可能性。另外，前期的研究也表明，hWAPL表达与pl6Ink4a有较好的相关性，并显示出对低级别宫颈上皮内瘤变具有良好的诊断价值。因此，象pl6Ink4a一样，本研究将进一步探讨hWAPL在细胞学诊断中的指导价值。

本研究显示，hWAPL基因表达强度与细胞学结果之间存在一定关联性。按不同细胞学结果分组，hWAPL在HSIL、LSIL组的表达强度均明显高于NILM组的表达（均P＜0.05），而且在HSIL组的表达强度也明显高于LSIL组的表达（P＜0.05）。上述结果表明hWAPL基因表达的强度与HSIL、LSIL和NILM之间的病变程度相关。

ASCUS和ASC-H是两种还不甚明确、需要进一步进行排他性诊断的结果，在实际操作中一直较具争议。本研究中我们发现ASCUS和ASC-H两组中所包含的SCC和CINⅢ病变均超过了该组病例数的50%以上。我们研究还发现，hWAPL在SCC+CINⅢ组的表达强度显著高于其在CINⅡ+CINⅠ+慢性宫颈炎组中的表达，结果提示hWAPL表达强度与ASCUS中的高级别病变程度具有相关性。

综上所述，hWAPL基因表达强度与HSIL、LSIL和NILM之间的病变程度相关；hWAPL表达强度对进一步诊断ASCUS中的高级别病变具有一定的参考价值。

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2014-10-28）

（本文编辑：沈昱平）

浙江省公益技术研究社会发展项目（2012C33059）

314400海宁市人民医院外科（沈鹏）；海宁市妇幼保健院病理科（陈林龙）；嘉兴学院病理学教研室（谢永红）

沈鹏，E-mail：394410508@qq.com