miR-29a在系统性红斑狼疮患者血浆中的表达及意义

徐玲娟 叶璐璐 陈阿琼 黄茜茜 章慧娣 陈朝生 薛向阳

miR-29a在系统性红斑狼疮患者血浆中的表达及意义

徐玲娟 叶璐璐 陈阿琼 黄茜茜 章慧娣 陈朝生 薛向阳

目的钼分析microRNA-29a（miR-29a）在系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆中的表达水平及与SLE临床特征的相关性。 方法 建立检测miR-29a的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法，分析48例SLE患者和20例健康体检者血浆中miR-29a的表达水平，ROC曲线评估其作为SLE诊断标记物的意义，统计分析其表达与SLE患者临床特征的相关性。 结果 与健康体检者比较，SLE患者血浆miR-29a表达水平明显上调（Z=3.476，P=0.0009）；血清miR-29a诊断SLE的ROC AUC为0.794（95%CI: 0.689～0.898），具较好诊断SLE的效能；抗β2GP1抗体＞20RU/ml患者的血浆miR-29a水平明显升高（P=0.033），Pearson相关分析显示，SLE患者血浆miR-29a表达水平与抗β2GP1抗体水平呈正相关（r=0.584，P=0.001），而与不同SLEDAI评分及其他SLE活动相关指标等差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 结论 miR-29a在SLE患者血浆中的表达水平明显上调，且血浆miR-29a上调与SLE患者自身抗体水平相关，其调节机制尚待进一步的研究。

系统性红斑狼疮 临床诊断 微小RNA miR-29a

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见、累及多系统的自身免疫性疾病。microRNA（miRNA）是一类长度约为19～23个核苷酸的非编码RNA，通过互补配对在转录后水平调控其特定靶基因的表达[1]。近年来的研究发现，血浆（血清）、唾液、尿液、乳汁等细胞外体液中也存在miRNAs[2-4]。其中一些血浆（血清）miRNA被证明可用于肿瘤、心血管疾病、糖尿病等多种疾病的生物标志物[5-8]。笔者前期采用miRNA芯片分析SLE患者miRNA表达发现，与正常对照者比较，SLE患者血浆中miR-29家族成员的miR-29a表达明显升高。有研究显示，miR-29家族可调节T、B细胞的发育及功能，是一种强有力的免疫调节剂[9-11]。本研究进一步通过定量PCR检测SLE患者血浆miR-29a的表达水平，探讨其与SLE临床特征的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2011年3月至2013年9月由浙江中医药大学附属金华市中医医院肾病风湿免疫科收治的SLE患者48例，其中男5例，女43例，年龄20～65岁，中位年龄35岁。所有患者均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE诊断标准，采用SLE病情活动评分（SLEDAI评分）评估疾病活动度。选取同期浙江中医药大学附属金华市中医医院健康体检者20例作为健康对照组，其中男3例，女17例，年龄18～56岁，中位年龄32岁。排除心血管、肿瘤以及其他自身免疫性疾病。两组性别、年龄比较均无统计学差异（均P＞0.05）。

1.2 主要试剂 Tri-Reagent BD试剂购自美国Sigma公司，ReverTra Ace qPCR RT Kit逆转录试剂盒及SYBR Master Mix定量PCR试剂购自日本Toyobo公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水购自宝生物工程（大连）有限公司，其他试剂均为分析纯，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本收集及保存 取EDTA抗凝的外周血，4℃，3 000r/min离心10min，收集血浆，进一步去除残留的细胞碎片，4℃，12 000r/min离心10min。血浆标本置-80℃冰箱保存。

1.3.2 血浆 RNA抽提 按Tri-Reagent BD试剂说明书步骤抽提血浆RNA。为增加RNA得率，在抽提时加入1μl糖元损失，并采用80%乙醇洗涤RNA沉淀。以DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存。为消除血浆RNA抽提的误差，每份标本均取200μl，而且抽提前加入1μl与人miRNAs无同源性的cel-miR-39外参照。

1.3.3 miR-29a表达的检测 按照ReverTra Ace qPCR RT Kit逆转录试剂盒说明书，以5μl血浆RNA以miR-29a茎环RT引物进行逆转录。茎环RT引物序列为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGTATTCGCACTGGATACGACTAACCGAT-3′。逆转录反应条件为16℃退火30min，42℃延伸30min，98℃5min终止反应。逆转录产物-20℃保存。以20μl反应体系进行定量PCR检测miR-29a表达，PCR反应体系含：逆转录产物1μl，0.5μmol/ L miR-29a特异性正向引物，0.5μmol/L miR-29a特异性反向引物，SYBR Master Mix-Plus 10μl，Plus solution 2μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，95℃变性15s，60℃退火、延伸1min，循环40次。miR-29a特异正向引物序列为5′-ATGGTTCGTGGGTAGCACCATCTGAAAT-3′，特异反向引物为5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。外参照cel-miR-39的检测按照QIAGEN公司荧光定量PCR检测试剂盒进行，每个样品有3个复孔。采用ABI 7500实时定量PCR仪进行检测，记录每个孔中荧光信号到达设定阈值时的循环数（Ct值）。根据待测标本的Ct值，以cel-miR-39作为外参照，采用定量PCR中的相对定量法，以N=2-△Ct表示标本中miR-29a相对表达量，其中△Ct=CtmiR-29a-Ctcel-miR-39。为方便数据计算，所有数值均放大10 000倍。PCR产物采用4%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以中位数及四分位间距表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用ROC曲线分析miR-29a检测结果诊断SLE的灵敏度和特异度，miR-29a表达水平与抗β2GP1抗体水平的相关性采用Pearson相关。

2 结果

2.1 血浆miR-29a检测的特异性分析 miR-29a定量PCR特异度分析见图1。miR-29a定量PCR的溶解曲线为单峰，其PCR产物经4%琼脂糖凝胶电泳显示为单一条带，而未逆转录的RNA对照及空白对照均无扩增产物，说明建立的定量PCR体系可以特异检测血浆标本中miR-29a。

图1 miR-29a定量PCR特异度分析（A：4%琼脂糖凝胶电泳miR-29a PCR产物的结果；B：miR-29a定量PCR的溶解曲线）

2.2 SLE患者血浆miR-29a水平的表达 SLE患者及健康对照组血浆中miR-29a表达水平为分别10.40（6.09，17.86）和4.07（3.60，6.02），两组比较差异有统计学意义（Z=3.476，P=0.0009），详见图2。血清miR-29a诊断SLE的ROC AUC为0.794（95%CI:0.689～0.898），以1.0255作为诊断阈值，其灵敏度为0.755，特异度为0.75，详见图3。

图2 SLE患者和健康对照组血浆miR-29a表达水平的比较

图3 SLE患者血浆miR-29a诊断的ROC曲线

图4 SLE患者血浆miR-29a表达与抗β2GP1抗体水平关系散点图

2.3 SLE患者血浆miR-29a表达水平与SLE常见临床特征的相关性 不同外周血中血小板、抗β2GP1抗体水平SLE患者血浆miR-29a表达水平的差异有统计学意义（均P＜0.05），而不同年龄、性别、ALT、AST等肝损害相关指标，血尿、蛋白尿等肾功能相关指标及CRP、C3、SLEDAI评分等SLE活动程度临床指标SLE患者血浆miR-29a表达水平的差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见表1。Pearson相关分析显示，SLE患者血浆miR-29a表达水平与循环中抗β2GP1抗体水平呈正相关（r=0.584，P=0.001），详见图4。

3 讨论

作为细胞内基因表达调节网络的重要调节者，miRNA已被证实参与了免疫细胞的分化、功能及各种自身免疫性疾病发生、发展过程[12]。细胞外游离的miRNA作为疾病标志物是近年来研究的热点。许多血浆miRNA已被证实是癌症、心血管疾病等多种疾病的生物标志[6-7,13]。但关于血浆（血清）miRNA与SLE相关性仅少数报道，发现了血清中miR-200家族、miR-205、miR-192、miR-146a、miR-142-3p、miR-126、miR-125a-3p、miR-155、miRNA-142-3p、miR-181a、miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-203、miR-92a、miR-342-3p、miR-223及miR-20a等表达及作为SLE生物标记的可能[14-17]。由于标本来源及检测手段不同，不同研究者得到的结果也不尽相同。

miR-29a属于miR-29家族中的一员，人类miR-29家族还包括miR-29b和miR-29c。许多研究已经证实[18-21]，下调表达的miR-29a在多种肿瘤的增殖、转移过程中发挥重要调节作用。在急性髓细胞白血病的研究中发现，miR-29a表达水平越低，其复发缓解时间越短，预后越差[22]。已经证实，内皮细胞中的miR-29a可通过作用于磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN），刺激血管生长[23]；此外，miR-29a通过调节靶基因Ⅰ型胶原mRNA，同时能降低成纤维细胞增殖，导致过多的胶原生成[24]。另外，已经证明，miR-29可调控IFN-γ[11]、B7-H3共刺激分子[25]、缓激肽受体2（BDKR2）、CCL8、紧密连接蛋白1（CLDN-1），吲哚胺双加氧酶（IDO）、IL-2受体α链（IL-2RA）、IL-12p40等[26]重要免疫调节分子的表达。近期Qin等[27]在SLE的CD4+T细胞中发现与miR-29a同家族的miR-29b表达水平上调，并通过抑制DNMT1的表达，从而使CD4+T细胞中DNA低甲基化。有研究证实，在狼疮活动患者的T细胞中呈现出DNA甲基化全面减少，而且T细胞中的甲基化水平与狼疮疾病活动有关[28-30]。本研究通过定量PCR分析发现，SLE患者血浆中的miR-29a表达水平明显上调，但未发现miR-29a与SLE疾病活动度有相关性。

表1 SLE患者血浆miR-29a表达水平与SLE常见临床特征的相关性

在对临床相关性资料作进一步分析后发现，抗组蛋白抗体及抗β2GP1抗体＞20RU/ml患者血浆miR-29a水平明显升高，且miR-29a的表达水平与循环中抗β2GP1抗体水平呈正相关。已经明确，B细胞过度活化增殖产生多种自身抗体（尤其是抗核抗体）不但是SLE活动的重要指标，而且是SLE发病机制的中心环节。这些结果提示血浆miR-29a可能和SLE患者自身反应性B细胞的功能有关。本研究结果还发现，血浆中miR-29a的表达水平与SLE患者血小板数量有关，提示检测miR-29a对临床判断SLE继发血小板减少有一定价值。

综上所述，SLE患者血浆miR-29a表达水平上调可能与自身抗体产生及血液系统损害相关，为SLE患者病情临床评价及干预治疗提供了一条新的线索，其调节机制尚待进一步的研究。

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Expression of miR-29a in plasma of patients with systemic lupus erythematosus and its clinical significance

XU Linjuan,YE Lulu，CHEN Aqiong,et al.Department of Clinical Laboratory,Affiliated Jinhua TCM Hospital,Zhejiang Chinese Medical University, Jinhua 321017,China

Objective To investigate the expression of microRNA-29a(miR-29a)in plasma of patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and its clinical significance. Methods The expression of plasma miR-29a was detected with real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR）in 48 SLE patients and 20 healthy subjects.The value of miR-29a for diagnosis of SLE was assessed by the receiver operating characteristic (ROC)curve.The relationship between the plasma miR-29a levels and clinical characteristics was analyzed. Results Compared with the healthy controls,the expression of miR-29a in plasma of patients with SLE was significantly higher(Z=3.476,P=0.0009).The area under the curve(AUC)of ROC was 0.794(95%CI: 0.689-0.898).Patients with positive anti-β2GP1 antibody showed higher miR-29a levels in plasma than those with negative anti-β2GP1 antibody(P=0.033).In addition,Pearson analysis indicated that the plasma level of miR-29a was positively correlated with the level of anti-β2GP1 antibodies(r=0.584,P=0.001).However,the SLEDAI score and other clinical indicators of SLE activation were not significantly correlated with the plasma level of miR-29a. Conclusion The expression of miR-29a in the plasma of SLE patients is up-regulated,which were associated with the levels of several auto-antibodies.

Systemic lupus erythematosus Clinical diagnosis MicroRNA MiR-29a

2015-02-06）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省科技厅科研基金资助项目（2012C33126）；浙江省大学生新苗计划（2015R413027）；金华市科技局科研基金资助项目（2013-3-014）

321017 浙江中医药大学附属金华市中医医院检验科（徐玲娟）；温州医科大学微生物学和免疫学教研室，分子病毒与疫苗研究所，热带医学研究所（叶璐璐、黄茜茜、薛向阳）；宁波李惠利医院风湿免疫科（陈阿琼）；温州医科大学附属第一医院肾内科（章慧娣、陈朝生）

薛向阳，E-mail：wyxyy001@163.com