前列腺素E1对糖尿病大鼠阴茎海绵体细胞Bcl-2、Bax表达的影响

万明发 冯亮 江明友 洪钟亮

●临床研究

前列腺素E1对糖尿病大鼠阴茎海绵体细胞Bcl-2、Bax表达的影响

万明发 冯亮 江明友 洪钟亮

目的 研究前列腺素E1（PGE1）对糖尿病大鼠阴茎海绵体细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响并探讨其改善勃起功能的机制。方法 通过腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg建立糖尿病（DM）Wistar大鼠模型，然后随机分成DM组和DM+PGE1组，DM+PGE1组给予PGE10.2μg/（kg·d）肌肉注射。10周后获取大鼠阴茎海绵体组织，用原位末端标记（TUNEL）法检测阴茎海绵体细胞凋亡，免疫组化方法检测海绵体细胞中Bcl-2、Bax的表达。结果 DM组大鼠阴茎勃起功能明显低于DM+PGE1组，阴茎海绵体凋亡细胞数明显多于DM+PGE1组，Bax表达增强，Bcl-2表达减弱（均P＜0.05）。结论 PGE1可能通过下调Bax和上调Bcl-2的表达使DM大鼠阴茎海绵体细胞凋亡减少，从而改善阴茎勃起功能。

糖尿病 阴茎海绵体 凋亡 Bcl-2 Bax

糖尿病（DM）是由胰岛素分泌缺陷和（或）作用缺陷而导致的一种代谢性疾病。勃起功能障碍（ED）指不能获得或维持勃起以完成令人满意的性交过程。ED是DM的常见并发症，由DM诱发的ED称之为糖尿病性ED（DIED）[1]。

前列腺素E1（PGE1）是一种具有多种生物活性的血管扩张剂，具有扩张大血管和改善微循环的双重作用。通过阴茎注射PGE1能改善勃起功能，但其治疗DIED的机制以及对阴茎海绵体细胞凋亡的影响尚未见于报道。本研究通过建立DM大鼠模型，研究PGE1对阴茎海绵体细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax和Bcl－2表达的影响，以期为DIED的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物模型及分组 纯系成年雄性Wistar大鼠50只，购于南昌大学医学院动物研究所，体重250～300g。每只大鼠进入研究前，性功能均正常（由与发情雌鼠交配证实）。将大鼠完全随机分组为：正常对照组（NDM组）10只，DM建模组40只。DM建模方法：用0.1mmol/ L的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（pH＝4.2）配制新鲜的1%链脲佐菌素（STZ）溶液，DM建模组每只大鼠于左下腹腹腔注射STZ 65mg/kg。正常对照组腹腔注射相应剂量的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液。2周后检测血糖，血糖＞16.7mmol/L持续3d者判定为DM建模成功，共有36只大鼠建模成功。再将DM建模成功的大鼠完全随机分成两组，每组18只，其中DM+PGE1组给予PGE10.2μg/（kg·d）肌肉注射；DM组与NDM组肌肉注射相应剂量0.9%氯化钠注射液。所有大鼠自由饮食，昼夜交替饲养，观察生活情况。从注射PGE1起共饲养10周，待完成勃起功能检测后处死。

1.2 试剂 STZ、阿朴吗啡（APO）、生物素化抗地高辛抗体购自美国Sigma公司。PGE1粉针剂（北京泰德制药有限公司产品，批号：200904201，商品名：凯时，10μg/支），使用前以0.9%氯化钠注射液稀释成1mg/L。原位末端标记（TUNEL）检测试剂盒、Bcl-2和Bax免疫组化试剂盒、链霉亲合素-生物素-过氧化物酶（SABC）、蛋白酶K、标记缓冲液、3，3-二氨基联苯胺（DAB）、Tris缓冲液（TBS）均购于武汉博士德生物工程公司；末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）购自美国Promega公司；地高辛标记的dUTP（DIG-dUTP）购自德国BM公司。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠阴茎勃起功能检测 采用Ledda[2]报道的方法，于饲养结束后在大鼠颈部皮下注射APO 150μg/ kg，每只大鼠注射后观察30min，记录阴茎勃起次数。以阴茎充血并末端阴茎露出为勃起1次。勃起率为每组中有阴茎勃起的大鼠所占百分比。

1.3.2 大鼠阴茎海绵体细胞凋亡检测 采用TUNEL法，大鼠阴茎组织切片常规脱蜡水化，经3%H2O2处理、蛋白酶K消化，加入TdT和DIG-dUTP后4℃过夜，封闭后加生物素化抗地高辛抗体并洗涤，SABC、DAB显色。光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。

1.3.3 免疫组化检测阴茎海绵体细胞Bcl-2、Bax的表达 4μm阴茎组织切片常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠Bax或Bcl-2单克隆抗体（1∶150稀释），二抗为生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀释），以0.01mol/L的PBS（pH=7.4）代替一抗作为阴性对照，DAB显色，400倍光镜下观察。光镜下随机选取10个视野，计算每个视野下阳性细胞数占细胞总数的百分比，取均值作为该指标表达阳性率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用q检验。计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 各组大鼠阴茎勃起功能检测 各组大鼠皮下注射APO后都有活动增加，毛发竖立等表现。NDM组勃起次数（3.52±1.32）次，勃起率100.0%；DM组勃起次数（1.00±0.00）次，勃起率20.0%；DM+PGE1组勃起次数（3.10±1.16）次，勃起率61.5%。DM组与NDM组、DM+PGE1组比较，以及DM+PGE1组与NDM组比较，阴茎勃起次数和勃起率均有统计学差异（均P＜0.05）。

2.2 各组大鼠阴茎海绵体细胞凋亡情况比较 DM组中凋亡细胞最多，而NDM组中较少，DM+PGE1组介于两者间，3组间比较有统计学差异（P＜0.05）。各组大鼠阴茎海绵体细胞凋亡率比较见表1。光镜下见海绵体组织中平滑肌细胞和窦内皮细胞均有凋亡，染色呈黄褐色，核染色质出现浓缩、边聚、碎裂等，有的还伴随有细胞形态改变，见图1。

2.3 各组大鼠阴茎海绵体细胞Bcl-2、Bax表达阳性率比较 DM组和DM+PGE1组大鼠阴茎海绵体细胞的Bax表达阳性率高于NDM组，Bcl-2表达阳性率低于NDM组；进一步比较，DM组Bax表达高于DM+ PGE1组，Bcl-2表达则低于DM+PGE1组，组间比较均有统计学差异（均P＜0.05），见表1及图2。

表1 各组大鼠阴茎海绵体细胞凋亡率及Bax、Bcl-2表达阳性率比较（%）

图1 各组大鼠阴茎海绵体细胞凋亡情况（A：NDM组；B：DM+PGE1组；C：DM组；TUNEL法染色，×400）

图2 各组大鼠阴茎海绵体细胞Bcl-2、Bax表达情况（A、B、C分别为NDM组、DM组、DM+PGE1组Bax表达；D、E、F分别为NDM组、DM组、DM+PGE1组Bcl-2表达；DAB染色，×400）

3 讨论

ED是DM最常见也是最容易被忽视的并发症，DM的病程长，血糖控制不良，出现大血管、微血管和神经病变等并发症都会导致ED的发病率增加[3]。DM患者发生ED的发病机制目前尚不清楚，一般认为与DM所致的周围神经病变使神经传导产生障碍，并引起与阴茎勃起有关的神经递质浓度改变；雄激素的合成和分泌减少；糖基化终末产物（AGEs）使局部一氧化氮（NO）灭活增加以及产生大量的氧自由基等因素有关。尤其是体内高血糖环境下氧自由基生成增加，脂质过氧化作用增强，促进细胞凋亡等机制在ED的发生过程中起到了重要作用[4-6]。

PGE1是一种有效的血管活性物质，有较强的扩张阴茎小动脉和松弛阴茎海绵体平滑肌的作用，前者使进入海绵体的血液量增加，后者使微小静脉受压关闭进而减少血液流出量，从而使阴茎有效勃起。从此原理出发，目前临床上应用阴茎海绵体注射PGE1治疗ED，取得良好的疗效。然而笔者观察到DIED大鼠应用PGE1后勃起功能得到明显改善，PGE1除了通过直接扩张血管发挥作用之外，是否还通过其它机制起到治疗ED的作用尚不明确。

近年来细胞凋亡的基因调控倍受关注，其中Bcl-2家族在细胞凋亡过程中的作用成为研究热点。Bcl-2是一个基因家族，可抑制各种原因所致的细胞凋亡[7]。Bcl-2家族中还包括它的同源蛋白Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bad等。当Bax同源二聚体形成便诱导凋亡，而随Bcl-2蛋白表达量上升，越来越多的Bax二聚体分离，与Bcl-2形成更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体，从而抑制了Bax诱导凋亡的作用，即细胞内Bax和Bcl-2的比例调节了凋亡的发生。当Bcl-2/Bax比例上调时，细胞对凋亡信号的反应性降低，从而抑制细胞凋亡；当Bcl-2/Bax比例下调时，细胞对凋亡信号的反应性增强，从而促进凋亡发生。免疫组化染色可以敏感地检测到损伤因素作用下的细胞内成分表达的变化。本研究通过对DM大鼠模型的实验研究发现，DM组大鼠Bax表达增加及Bcl-2表达减少与凋亡细胞数的增加一致，说明Bax和Bcl-2参与了DM大鼠阴茎海绵体细胞凋亡的调控。以PGE1干预后，DM大鼠阴茎海绵体凋亡细胞数目显著减少，Bax表达下调，Bcl-2表达上升，说明PGE1对减少DM大鼠阴茎海绵体细胞凋亡有着积极的影响。

总之，Bcl-2和Bax在DM患者阴茎海绵体细胞凋亡过程中起重要的作用，而关于DM情况下阴茎海绵体细胞凋亡的确切机制有待进一步研究。

[1] Thorve V S,Kshirsagar A D,Vyawahare N S,et al.Diabetes-induced erectile dysfunction:epidemiology,pathophysiology and management[J].J Diabetes Complications,2010,25(2):129-136.

[2] Ledda A.Diabetes,hypertension and erectile dysfunction[J].Curr Med Res Opin,2000,16(suppl 1):S17-S20.

[3]朱选文,李方印,方家杰.他达拉非治疗勃起功能障碍的疗效和安全性临床观察(附80例报告)[J].中华男科学杂志,2006,12(5):421-423.

[4] Ansar M M,Ansari M.Nitric oxide involvement in pancreatic beta cellapoptosis by glibenclamide[J].Nitric Oxide,2006,14(1):39-44.

[5] Lukivskaya O,Patsenker E,Buko V U.Protective effect of ur sodeoxycholic acid on liver mitochondrial function in rats with al loxan-induced diabetes:link with oxidative stress[J].Life Sci,2007, 80(26):2397-2402.

[6] 黎英荣,肖常青,潘海林,等.糖尿病大鼠阴茎组织NOS各亚型表达及细胞凋亡的研究[J].中国糖尿病杂志,2007,15(6):372-373.

[7] Hawkins C J,Vaux D L.Analysis of the role of bcl-2 in apoptosis [J].Immunol Rev,1994,142:127-139.

Effects of PGE1on apoptosis and expression of Bcl-2 and Bax in corpora cavernosal cells of diabetic rats

WAN Mingfa,FENG Liang, JIANG Mingyou,et al.
Department of Urology,the First People's Hospital of Tonglu,Tonglu 311500,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of PGE1on apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax in corpora cavernosal cells of diabetic rats. Methods Diabetes model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin in male adult Wistar rats,the animals were randomly divided into DM group(n=18)and DM+PGE1group(n=18).The rats in DM+PGE1group were treated with intravenous injection of 0.2μg/kg PGE1daily for 10 weeks.After 10 weeks,the penis corpora cavernosal tissues were harvested.Cell apoptosis was evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Immunohistochemistry was employed to detect the expression of Bcl-2 and Bax. Results Compared with rats in group DM,the function of erectile was improved significantly in group DM+PGE1.The number of cell apoptosis was higher,the expression of Bax was stronger and expression of Bcl-2 was weaker in DM group than those in group DM+PGE1. Conclusion PGE1can reduce the apoptosis of penis corpora cavernosal cells in diabetic rats by down-regulating Bax and up-regulating Bcl-2 expression,resulting in the improvement of erectile function.

Diabetes Penis cavernosal tissue Apoptosis Bcl-2 Bax

2014-06-04）

（本文编辑：胥昀）

311500 桐庐县第一人民医院泌尿外科（万明发、江明友、洪钟亮）；南昌大学第一附属医院泌尿外科（冯亮）