维生素D和维生素D结合蛋白在非小细胞肺癌患者中的表达及其对预后的影响

余晓燕 陆启光 姚杨伟

●论 著

维生素D和维生素D结合蛋白在非小细胞肺癌患者中的表达及其对预后的影响

余晓燕 陆启光 姚杨伟

目的 探讨维生素D和维生素D结合蛋白（DBP）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的表达及其对预后的影响。方法 选取74例NSCLC患者，采用ELISA法检测患者血清中25（OH）D和DBP的浓度。分析其与患者临床病理特征（包括性别、年龄、肿块大小、淋巴结转移情况、分化程度、组织学类型以及病理分期）及预后的关系。以NSCLC患者的癌旁正常肺组织作为对照，用Western blot检测患者肺癌组织中DBP的表达情况。结果 与癌旁正常肺组织比较，DBP在NSCLC组织中表达下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。血清中维生素D和DBP浓度与患者年龄、淋巴结转移及病理分期相关（P＜0.05或0.01）。依据维生素D浓度将患者分为A组[25（OH）D＜25ng/ml]、B组[25ng/ml≤25（OH）D＜40ng/ml]、C组[25（OH）D≥40ng/ml]，依据DBP浓度将患者分为a组（DBP＜20mg/dl）、b组（20mg/dl≤DBP＜40mg/dl）、c组（DBP≥40mg/dl），随着两者浓度增高，患者生存曲线依次上移。Cox比例风险回归模型分析显示，维生素D和DBP的高表达是患者预后的保护因素（均P＜0.05）。结论 血清中维生素D和DBP浓度高低在NSCLC的发生、发展过程中具有重要意义，两者可作为NSCLC患者预后评估的辅助指标。

维生素D 维生素D结合蛋白 非小细胞肺癌 预后

【 Abstract】 Objective To determine serum vitamin D(VD)and vitamin D-binding protein(DBP)levels in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its association with the survival of patients. Methods Seventy four NSCLC patients undergoing surgical treatment were included in the study.The serum VD and DBP levels were measured with ELISA and the expression of VD and DBP in lung cancer tissue were detected with Western blot.The association of VD and DBP expression with the cliniopathological parameters and survival of patients was analyzed. Results Serum VD and DBP levels were correlated with pathological stage,lymph node metastasis and ages of patients(P＜0.05 or 0.01).And serum VD and DBP levels were positively correlated with survival of patients.Multivariate analysis revealed that serum VD and DBP level was an independent prognostic indicator for overall survival of patients(both P＜0.05).Compared with corresponding normal lung tissue,the expression of VD and DBP in lung cancer tissue was down-regulated(P＜0.01). Conclusion VD and DBP expression in serum and cancer tissue are decreased in patients with NSCLC,and VD and DBP levels may be used for predicting survival of NSCLC patients.

肺癌是目前全球范围内病死率最高的恶性肿瘤，每年新增病例达120万例，其中最常见的病理类型为非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）[1]，约占80%。维生素D是一种脂溶性维生素，其在循环系统的主要存在形式为25（OH）D，研究发现其不仅在钙磷代谢方面发挥作用，而且能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和血管新生，并能促进肿瘤细胞凋亡[2]。维生素D结合蛋白（vitamin D－binding protein，DBP）是一种相对分子量为51 000～58 000的多功能血浆球蛋白，主要合成于肝脏，参与维生素D及其代谢产物的转运和代谢，并在肌动蛋白、内毒素和异常细胞的清除过程中起到了重要作用[3]。多项研究发现血清中维生素D浓度与NSCLC患者的存活时间相关[4]。本研究旨在通过测定血清中维生素D和DBP浓度以及组织中DBP的表达，探究维生素D和DBP在NSCLC诊治中的临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2006年8至11月在嘉兴第二医院手术的74例NSCLC患者为研究对象，其中男54例，女20例，年龄33～77岁，平均（64.12±6.43）岁。所有患者均于入院后第2天采集血液标本并于术后留取肿瘤组织标本，以离肿瘤边缘5cm以上且病理证实无癌细胞浸润的癌旁正常肺组织作为对照。采集的血清和组织标本均储存于－80℃的低温冰箱中。对患者采用电话随访及门诊复诊的方式，随访截止时间为2011年8月30日。74例患者中有6例失访，其中5例联系中断，1例不愿接受随访。总生存时间定义为从手术之日至任何原因引起的死亡或者随访的终点。

1.2 试剂和仪器 DBP和25（OH）D检测ELISA试剂盒均购于德国Immundia公司，抗DBP抗体、抗β－actin抗体以及多克隆羊抗鼠二抗为英国Abcam公司产品，免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，电泳仪及附件、转膜仪及附件均为美国BIO－RAD公司产品。

1.3 方法

1.3.1 血清DBP和25（OH）D浓度测定 所有患者均于入院后第2天空腹抽取静脉血4ml，室温放置2h后1 000g/min离心20min分离血清，以ELISA间接法检测血清DBP和25（OH）D蛋白浓度，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，酶标仪450nm波长下测量各孔的光密度（OD值）。

1.3.2 Western blot检测肺组织DBP表达 从保存的组织中提取蛋白，Lowry法测定蛋白浓度。上样检测，化学发光试剂显色，胶片贴近曝光，显影、定影后采用Image J图像分析软件进行定量分析。蛋白相对表达量以与内参照β－actin的表达之比表示。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，自身对照比较采用配对t检验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。计数资料组间比较采用χ2检验。采用Kaplan－Meier法绘制生存曲线，维生素D和DBP的浓度与患者预后的关系采用Cox比例风险回归模型进行分析。

2 结果

2.1 NSCLC患者肺组织DBP表达情况 Western blot结果提示，DBP在NSCLC组织中的相对表达量（DBP/ β－actin）为0.046±0.013，而癌旁正常肺组织中的相对表达量为2.850±0.230，两者比较有统计学差异（P＜0.01），见图1。

图1 NSCLC患者肺组织DBP表达情况（T：肿瘤组织；N：癌旁正常肺组织；数字代表随机抽取样本标记）

2.2 血清中DBP和25（OH）D浓度与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 血清中DBP和25(OH)D浓度与患者临床病理特征的关系

由表1可见，不同性别、组织学类型、肿瘤大小NSCLC患者的DBP浓度和25（OH）D浓度均无统计学差异（均P＞0.05），而在不同年龄、淋巴结转移、病理分期的患者间DBP浓度和25（OH）D浓度均有统计学差异（P＜0.05或0.01）。

2.3 影响NSCLC患者预后的因素 Cox比例风险回归模型提示，性别、肿瘤大小、组织学类型不是NSCLC患者预后的影响因素（均P＞0.05），而年龄、淋巴结转移、病理分期、DBP浓度和25（OH）D浓度是NSCLC患者预后的影响因素（P＜0.05或0.01），见表2。

2.4 血清中维生素D和DBP浓度与NSCLC患者预后的关系 根据DBP浓度将患者分为a组（DBP＜20mg/ dl）、b组（20mg/dl≤DBP＜40mg/dl）、c组（DBP≥40mg/dl），根据25（OH）D浓度将患者分为A组[25（OH）D＜25ng/ml]、B组[25ng/ml≤25（OH）D＜40ng/ml]、C组[25（OH）D≥40ng/ml]。Cox比例风险回归模型分析显示，DBP和25（OH）D的高表达是预后的保护因素（均P＜0.05），各组患者生存曲线见图2-3。

表2 影响NSCLC患者预后的因素

图2 不同DBP浓度患者的生存曲线

图3 不同25（OH）D浓度患者的生存曲线

3 讨论

DBP是血液中维生素D的主要转运蛋白，大约88%的维生素D由DBP转运。DBP除了作为循环系统中维生素D的转运体，还有着多种生物学功能。它能够结合并清除细胞外肌动蛋白，以及从受损组织和死亡细胞中释放的球状肌动蛋白，从而避免循环系统中肌动蛋白堵塞血管[3]。DBP也参与免疫应答，在去糖基化酶的作用下能够转换成巨噬细胞激活因子，从而具有抗血管新生和抗肿瘤的作用[5]。在炎症反应中DBP还能够促进中性粒细胞的趋化[6]。α-生育酚、β-胡萝卜素癌症预防研究中发现，血清中的DBP能够影响维生素D相关的胰腺癌[4]、前列腺癌[7]和膀胱癌[8]的患病率，同时对肾细胞癌的患病率也有影响[9]。

本研究发现，NSCLC患者癌组织中的DBP表达相对癌旁正常肺组织明显减少，血清中DBP的高表达是患者预后的保护因素，这一结果也证实了DBP的作用。DBP的作用机制可能与以下两方面有关：一方面通过结合维生素D起到抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和血管新生的作用，同时促进肿瘤细胞凋亡；另一方面通过转化为巨噬细胞激活因子激活巨噬细胞，促进中性粒细胞趋化作用，提高机体免疫功能，清除肿瘤细胞。本研究还发现NSCLC患者中血清中维生素D和DBP浓度受到患者年龄、淋巴结转移及肿瘤病理分期的影响。患者血清中维生素D浓度随患者年龄增大而降低，可能与老年患者维生素D补充及摄入不足有关，而DBP含量降低可能与老年人的免疫功能相对减弱有关。

Tretli等[10]在一个纳入210例肺癌患者的临床研究中报道血清中高浓度维生素D能够延长患者生存时间。Zhou等[11]研究发现那些血清维生素D浓度高的NSCLC患者生存时间较长。本研究结果同样也提示患者血清中维生素D高表达的NSCLC患者生存曲线上移，维生素D高表达是患者预后的保护因素。

总之，血清中维生素D和DBP浓度高低在NSCLC的发生、发展过程中具有重要意义，两者可作为NSCLC的预后评估的辅助指标。

[1]Anic G M,Weinstein S J,MondulAM,et al.Serum vitamin D,vitamin D binding protein,and lung cancer survival[J].Lung Cancer, 2014,86(3):297-303.

[2] Giovannucci E.The epidemiology of vitamin D and cancer incidence and mortality:a review (United States)[J].Cancer Causes Control,2005,16(2):83-95.

[3] Chun R F.New perspectives on the vitamin D binding protein[J]. CellBiochem Funct,2012,30(6):445-456.

[4] Weinstein S J,Stolzenberg-Solomon R Z,Kopp W,et al.Impact of circulating vitamin D binding protein levels on the association be-tween 25-hydroxyvitamin D and pancreatic cancer risk:a nested case-controlstudy[J].Cancer Res,2012,72(5):1190-1198.

[5] Yamamoto N,Homma S.Vitamin D3 binding protein(group-specific component)is a precursor for the macrophage-activating signal factor from lysophosphatidylcholine-treated lymphocytes [J].Pro NatlAcad SciU S A,1991,88(19):8539-8543.

[6] Nagasawa H,Uto Y,SasakiH,et al.Gc protein(vitamin D-binding protein):Gc genotyping and GcMAF precursor activity[J].Anticancer Res,2005,25(6A):3689-3695.

[7] Weinstein S J,MondulAM,Kopp W,et al.Circulating 25-hydroxyvitamin D,vitamin D-binding protein and risk of prostate cancer [J].Int J Cancer,2013,132(12):2940-2947.

[8] MondulA M,Weinstein S J,Virtamo J,et al.Influence of vitamin D binding protein on the association between circulating vitamin D and riskofbladdercancer[J].BrJ Cancer,2012,107(9):1589-1594.

[9] Mondul A M,Weinstein S J,Moy K A,et al.Vitamin D-binding protein,circulating vitamin D and risk ofrenalcellcarcinoma[J].Int J Cancer,2014,134(11):2699-2706.

[10] Tretli S,Schwartz G G,Torjesen P A,et al.Serum levels of 25-hydroxyvitamin D and survival in Norwegian patients with cancer of breast,colon,lung,and lymphoma:a population-based study[J].CancerCauses Control,2012,23(2):363-370.

[11] Zhou W,Heist R S,Liu G,et al.Circulating 25-hydroxyvitamin D levels predict survival in early-stage non-small-cell lung cancer patients[J].J Clin Oncol,2007,25(5):479-485.

Serum vitamin D and vitamin D-binding protein levels in non-small cell lung cancer and its association with prognosis of pa-tients

YU Xiaoyan,LU Qiguang,YAO Yangwei.
Department of Respiratory Medicine,the Second Hospital of Jiaxing,Jiaxing 314000,China

Vitamin D Vitamin D-binding protein Non-small cell lung cancer Prognosis

2014-12-11）

（本文编辑：胥昀）

本刊可直接用缩写的常用词汇

314000 嘉兴市第二医院呼吸科

姚杨伟，E-mail：yuyf_2000@163.com