细胞外基质对哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞免疫调节作用

陈忠仁 梁梅兰

支气管哮喘是一种气道慢性炎症疾病，由多种细胞和细胞组分参与。作为维持气道结构和功能重要成分的气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell，ASMCs)和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，在哮喘的疾病发生、发展 中 起了重要的作用［1，2］。ASMCs 在炎性反应中作用比较活跃，能够分泌多种炎性介质，产生一系列细胞因子，表达免疫细胞的黏附分子以及包括Fas 在内的一些细胞表面分子标志物，ASMCs 所分泌的这些因子能够促进ASMCs 自身的增殖［3～5］。ASMCs 还能够产生细胞外基质、基质金属蛋白酶和相关的抑制剂，促进有丝分裂的发生，是引起支气管哮喘气道狭窄的重要病理因素，如Ⅰ型胶原(type Ⅰcollagen，COL -1)、层黏蛋白(laminin，LA)等有显著增加，两者可相互影响。为了探讨这一问题，本实验将大鼠ASMCs 种植于用涂覆有ECM 的培养瓶中，采用Western blot 法检测哮喘ASMCs eotaxin、TGF-β1 蛋白的表达，探讨ECM 对哮喘大鼠ASMCs 免疫功能的调节作用。

材料与方法

1.材料:健康Wistar 雄性大鼠。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)﹑COL-1、LA、胎牛血清(fetus bovine serum，FBS)、木瓜蛋白酶﹑Ⅰ型胶原酶﹑牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购于美国Sigma 公司。小鼠抗肌动蛋白(α -actin)和Trizol 溶液购自美国GIBCO 公司。单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10%分离胶、4%浓缩胶、0.15mol/L NaCl 溶液、2 ×(5 ×)SDS 上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10 ×丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、抗体、化学发光试剂。

2.大鼠哮喘模型的建立及分组:(1)哮喘模型的建立:参照文献［7］中的方法，在大鼠后腿内侧皮下注射1ml 体积的0.9%生理盐水混合液(含有10mg 的OVA 以及200mg 的氢氧化铝);注射后第8 天重复上述步骤;注射第15 天玻璃容器中进行含有2%OVA 生理盐水的喷雾试验，对大鼠进行喷雾处理，每次喷雾量控制在50ml，每周喷雾3 次，每次30min，共进行15 天。当大鼠出现躁狂、呛咳、呼吸急促症状时，即哮喘模型制备成功。(2)大鼠分组:16 只大鼠随机分为两组，每组8只。哮喘组，利用OVA 制备模型;对照组，生理盐水替代OVA。

3.大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)的培养、鉴定和分组:(1)大鼠ASMCs 的培养:根据文献［8］报道的方法分离大鼠肺叶支气管的ASMCs。在OVA 或生理盐水激发2 周后，在第24h 进行麻醉取材。取肺后移入超净台，置于冰盒上。倒入已加双抗的D-HANKS 液，清洗肺部。清洗后的肺组织切成1～2mm 的组织块，将其置于消化液(含1mg/mlⅠ型胶原酶、1mg/ml 木瓜蛋白酶、10mg/mlBSA 的D -HANKS 液)中，37℃消化15min。消化完毕后，加入无血清的DMEM 培养基，980r/min，离心10min。弃上清，加入约1ml 含20%FBS 的DMEM。移入细胞瓶中，37℃、5%CO2孵箱培养，每隔3 天换液1 次，大约1 周时间，当细胞长满单层后，胰酶消化传代培养。实验所用的细胞培养至第2 ～5 代。ASMCs 的鉴定主要在显微镜观察细胞形态，并通过α-actin 进行细胞免疫荧光染色。

4.培养瓶的处理:根据参考文献［9］报道的方法，取无菌细胞培养瓶(50ml)，将同一浓度的COL -1 以及LA(10μg/ml)加入细胞瓶中，加入的体积覆盖瓶底即可，摇匀后放于37℃孵箱过夜培养。取出后无菌条件下加入0.1%的BSA 封闭，室温作用30min，弃掉液体，无血清DMEM 培养液清洗瓶底，吸干液体，再自然风干，可直接使用，或封好瓶口待用。

5.ASMCs 分组:分离培养得到两组大鼠的ASMCs，随机分为3 组。①空白组:细胞正常培养;②COL-1 组:将ASMCs传代接种在包被有COL -1(10μg/ml)的细胞瓶中;③LA 组:将ASMCs 传代接种在包被有LA(10μg/ml)的细胞瓶中。每组各3 瓶。

6. Western blot 法检测ASMCs 中eotaxin、TGF -β1 蛋白的表达:参照Santa Cruz 公司提供的蛋白提取方法，应用蛋白裂解缓冲液分别裂解细胞得到总蛋白。以牛血清蛋白作为标准品，绘制标准曲线，计算提取液的蛋白浓度。取总蛋白50μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，转膜、封闭，一抗的工作浓度1∶500，β -actin 作为内参照，封闭孵育二抗，工作浓度1∶1000。用ECL 化学发光试剂盒检测杂交信号。

7.统计学方法:采用SPSS 10.0 统计软件，实验数据均用均数±标准差(±s)表示，进行方差分析和q 检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.大鼠ASMCs 鉴定:如图1 所示，通过细胞形态及免疫荧光染色显示，分离得到的细胞形态长梭型，与平滑肌细胞形态形似，并且α -actin 的表达为阳性，可以判定培养的细胞为大鼠平滑肌细胞。

图1 气道平滑肌细胞α-actin DAB 染色阳性(SP，×400)

2.Western blot 法检测eotaxin、TGF -β1 蛋白的表达:如图2、图3 所示，通过分析每组条带的灰度值，对蛋白含量进行计算比较。从表1、图2、图3 中可看出，eotaxin、TGF-β1 蛋白在各组皆有表达，并且表达量各有不同:在哮喘模型组当中，哮喘干预组显著高于空白组，空白组含量显著高于正常对照组(P＜0.05);在正常对照组中，表达差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表1 大鼠气道平滑肌细胞eotaxin、TGF-β1 的表达含量(±s)

表1 大鼠气道平滑肌细胞eotaxin、TGF-β1 的表达含量(±s)

与哮喘空白组相比，#P ＜0.05;与正常对照组相比，* P ＜0.05

组别 eotaxin TGF-β1哮喘LA 39182 ±62# 37165 ±53#哮喘COL-1 42663 ±41# 32465 ±37#哮喘空白 38633 ±56* 31888 ±82*正常LA 16656 ±61 16583 ±47正常COL-1 16575 ±47 16578 ±52正常对照16525 ±58 16590 ±49

图2 eotaxin 蛋白电泳图

图3 TGF-β1 蛋白电泳图

讨 论

支气管哮喘是一种气道慢性非特异性炎症疾病，但随着疾病的进展，可出现气道重塑，这与ASMCs 的功能状况密切相关。ASMCs 是炎性因子的作用靶点，同时也可分泌多种细胞因子和免疫活性蛋白［10］。气道平滑肌细胞有两种表型:①以收缩功能为主的收缩型;②能合成、分泌及表达多种活性物质的合成型［11］。合成型气道平滑肌细胞可以旁分泌、自分泌等方式分泌多种活性物质参与支气管哮喘的病理、生理过程，启动和维持哮喘气道高反应，引起慢性炎症和气道重塑。以往观点认为，ASMCs 在哮喘发病过程中，在神经源性信号和炎性介质调控下，参与气管收缩和舒张的过程。随着不断地深入研究发现，ASMCs 不仅可以调节支气管的收缩和舒张，而且可分泌及表达多种免疫调节介质，参与气道慢性炎症和气道重塑的发生和发展。近年来发现ASMCs 有新的生物学功能，如向黏膜层迁移使平滑肌层增厚、合成及炎症网络调节功能及动力学异常等。ASMCs 与ECM 由于其组织结构特点，在哮喘的发生、发展过程中存在着紧密联系，它们相互作用，发挥其功能特点，以减少对支气管的不利影响。ASMCs 可分泌多种基质蛋白，减缓ECM 的降解，加速气道重建。受影响的ECM 又可调控ASMCs 的生存、增殖和迁移等生物学行为。研究表明，哮喘ASMCs 可分泌蛋白多糖、Ñ 型胶原、硫酸软骨素，使ECM 含量增加，这种作用不能被激素所抑制，并可分泌TIMP -1 和TIMP -2，抑制ECM 降解［12～14，15］。不同种类和数量的ECM 可影响ASMCs 的迁移速度、增殖效率、生存时间和上调平滑肌细胞的分泌功能，如FN 呈剂量依赖性促进ASMCs的增殖，种植于COL -1 和LA 的ASMCs 凋亡率下降［16］。目前还没有研究发现ECM 在ASMCs 免疫反应方面是否具有调节作用，以及怎样参与信号通路的转导。

在笔者的实验研究中，将eotaxin 及TGF -β1 作为探讨ASMCs 免疫功能的重要因素。嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)最早是在嗜酸性粒细胞浸润的支气管肺泡灌洗液中发现的，在人的多种组织中都能够检测到eotaxin mRNA 的表达，可由不同来源的细胞产生［17］。支气管哮喘的典型病理特征即嗜酸性粒细胞广泛浸润，而eotaxin 对嗜酸性粒细胞具有趋化作用，使其靶向迁移至炎性反应部位，加剧哮喘的炎性反应。同时，研究表明，eotaxin 也会影响ASMCs 在炎性反应时的迁移方向［18］。TGF -β 生物学主要功能与炎性反应相关，是一些炎性细胞的趋化剂，可由肺部多种免疫相关的细胞分泌;同时可以促进ECM 的表达并抑制其分解，对平滑肌细胞的增殖具有显著作用，并通过多种通路调控哮喘的疾病过程，气道平滑肌细胞可以分泌TGF -β［19，20］。基于这两种蛋白在免疫调节方面的功能，笔者将其作为研究ASMCs 的重要指标。

总之，本实验结果显示，ECM 对ASMCs 中eotaxin，TGF-β1 的表达有正调控作用，对哮喘气道平滑肌细胞的作用更为显著，这为今后防治哮喘提供了一个新的思路和方法。但ECM 通过何种途径调节哮喘ASMCs 的免疫功能还不是很清楚，这需要进行进一步研究。

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