葛根异黄酮类成分对缺氧复氧损伤心肌细胞保护作用的研究

包永睿， 王 帅， 杨欣欣， 孟宪生*， 蔡 琳

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连116600）

葛根异黄酮类成分对缺氧复氧损伤心肌细胞保护作用的研究

包永睿1，2，3， 王 帅1，2，3， 杨欣欣1，2，3， 孟宪生1，2，3*， 蔡 琳1

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连116600）

目的建立葛根异黄酮类成分的HPLC指纹图谱，分析其对心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的相关性。方法HPLC-TOF-MS法对葛根异黄酮各指纹峰进行辨认，并考察不同剂量葛根异黄酮给药组对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用，然后采用灰色关联分析法将峰面积和细胞存活率药效数据相关联。结果从HPLC指纹图谱中鉴定出7个葛根异黄酮类成分，分别为葛根素、3′-羟基葛根素、葛根素木糖苷、3′-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷和大豆苷元，这些成分的药效并无很大差异，相关系数最大值葛根素 （0.761 4）与最小值大豆苷 （0.670 8）之间相差不到0.1。结论葛根异黄酮保护缺氧复氧损伤心肌细胞的作用可能是通过多组分协同而发挥疗效。

葛根异黄酮；HPLC；心肌细胞；缺氧复氧损伤；灰色关联分析法；相关性

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根部［1］，临床主要用于治疗心脑血管疾病，研究表明［2］，异黄酮类成分是其发挥扩张血管、降低血管阻力、抗心律失常等药理作用的主要活性成分。本实验经前期提取纯化，已分离富集得到葛根异黄酮类组分 （纯度＞80%），现针对该组分建立HPLC指纹图谱，同时考察其对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用。然后，采用灰色关联分析法构建所鉴定出的7种主要成分与药效间的相关性，从而明确其治疗冠心病的药效物质基础，为葛根药材的质量控制提供依据，也给该植物的进一步研究开发奠定基础。

1 实验材料

1.1 主要仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；CP225D电子分析天平 （十万分之一，德国Sartorius公司）；Milli-Q超纯水处理装置（美国Millipore公司）；CO2培养箱（德国Nuaire公司）；AE31型倒置相差显微镜（德国Motic公司）；SUNRISE酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.2 主要试药 葛根药材购自河北省安国药材批发市场，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根部。葛根素对照品 （批号110752-200511），购自中国食品药品检定研究院；大豆苷 （批号 MUST-11121201）、大豆苷元 （批号MUST-12020708）对照品，均购自成都曼思特生物科技有限公司；葛根素-7-木糖苷 （批号130916）、葛根素木糖苷 （批号130913）对照品，均购自成都普菲德生物技术有限公司；甲醇、磷酸为色谱纯，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清，均购自美国Gibco公司。

1.3 细胞株与实验动物 原代乳鼠心肌细胞，本实验室自行培养；清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，购自大连医科大学实验动物中心，合格证号SCXX（辽）2008-0002。

2 实验方法

2.1 葛根异黄酮指纹图谱的建立与峰归属

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元、葛根素木糖苷、葛根素-7-木糖苷对照品适量，加甲醇分别制成每1 m L含大豆苷元0.083 0 mg、葛根素0.087 0 mg、大豆苷0.083 9 mg、葛根素木糖苷0.082 4 mg、葛根素-7-木糖苷0.083 3 mg的对照品溶液，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取葛根粉末（过40目筛）4、8、12 g，分别置于平底烧瓶中，70%乙醇回流提取3次，每次1 h，提取液过滤后浓缩，经AB-8大孔吸附树脂纯化，收集50%乙醇洗脱液，减压干燥后分别用水定容至50 mL量瓶中，0.45μm滤膜过滤，即得［3］。

2.1.3 HPLC色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；体积流量1.0 mL/min；柱温25℃；流动相为水 （A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，9%→10%B；10～15 min，10%→12%B；15～65 min，12%→14%B；65～67 min，14%→15%B；67～110 min，15%→30%B）；检测波长250 nm；进样量10μL［4］。

2.1.4 MS分析条件 电喷雾离子源，负离子模式检测；雾化气体为氮气；体积流量540 L/h；脱溶剂气体温度350℃；锥孔气流量50 L/h；离子源温度120℃；锥孔电压45 V；毛细管电压4 kV；雾化器压力35 psi；碎裂电压175 V；质谱图平均扫描速率0.2 s，扫描范围m/z100～1 100。应用Agilent MassHunter Qualitative Analysis软件对质谱图进行分析，同时研究供试品所含成分的裂解规律，并与对照品比对确认［5］。

2.2 葛根异黄酮对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用

2.2.1 原代乳鼠心肌细胞的培养 取新生SD小鼠若干只，无菌条件下开胸取心，洗净后将心室剪成碎块放入培养皿里，加入适量冷PBS，置于37℃水浴中用消化液多次消化，收集细胞悬液，差速贴壁法分离纯化心肌细胞，37℃下5%CO2培养箱中培养60 min，调整细胞密度至5×104个/mL，转接于96孔板上，37℃、5%CO2条件下培养。然后，选择生长状态良好的细胞，于72 h后进行实验［6-7］。

2.2.2 缺氧复氧损伤模型的制备 取接种完成的96孔板，每孔加入等量的H2O2（100μmol/L）损伤剂，在37℃、5%CO2条件下常规培养1 h后，换成正常的培养液，继续在相同条件下常规培养。

2.2.3 含药血浆对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用 将SD小鼠随机分为4组，每组6只，除1组为空白对照组外，其余3组分别为葛根高、中、低剂量组 （给药剂量按生药量计算，分别为0.8、1.6、2.4 g/kg），灌胃给药3 d，每天1次，每次0.5 mL。然后，摘除小鼠眼球取血，置于肝素化的EP管中，缓慢摇晃，离心15 min后吸取上清液，即为含药血浆，分装。然后，取已缺氧复氧的原代乳鼠心肌细胞，分别加入15%浓度的含药血浆，置于37℃、5%CO2培养箱中，培养24 h后，每孔避光加入MTT试剂20μL（5 mg/mL），37℃下继续孵育4 h，弃除上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，室温下摇床30 min。待紫色结晶充分溶解后，酶标仪在492 nm波长下测定OD值，计算药物对细胞的存活率［8］，计算公式如下。

细胞存活率=OD实验组/OD对照组×100%

2.3 统计学处理 实验数据用x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，组间比较用单因素方差和LSD检验分析。

2.4 灰色关联度分析 采用灰色关联分析法，将葛根异黄酮HPLC指纹图谱各峰的峰面积和细胞存活率药效数据相关联，将原始数据标准化转换后，计算其关联系数和关联度［9-12］。

3 实验结果

3.1 葛根异黄酮指纹图谱及药效学分析结果 见图1和表1。

图1 葛根异黄酮指纹图谱Fig.1 Fingerprint of pueraria isoflavones

表1 HPLC-MS与药效学分析结果Tab.1 HPLC-M S and pharmacodynam ic analysis results

其中，3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素是根据化合物自身裂解规律，并经文献 ［5］与相关数据库信息比对推测所得，其他化合物均为对照品指认成分。

3.2 灰色关联度分析结果 见图2和表2，根据药效-剂量关联直观分析结果，可大致分析因素数列的关联度。结果发现，峰面积与存活率较接近，表明关联度较好。

图2 药效-剂量关联图Fig.2 E fficacy-dose related graph

表2 灰色关联度分析系数Tab.2 Analysis coefficient of grey relation

由此可知，葛根异黄酮中的成分对缺氧复氧损伤模型的乳鼠心肌细胞存活率的影响依次为S2＞S5＞S4＞S1＞S3＞S7＞S6，即2号峰葛根素对细胞存活率影响最大，其次为葛根素木糖苷、葛根素-7-木糖苷、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷元与大豆苷。

4 讨论

在前期实验中，已分离富集得到纯度相对较高的葛根异黄酮类成分，而本实验在此基础上，采用HPLC-TOF-MS法建立了该类组分的指纹图谱，并对其化合物构成进行基本表征，结果鉴定出葛根素木糖苷、葛根素-7-木糖苷、3′-羟基葛根素等7种主要成分。同时，体外细胞实验考察了其对缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞的保护作用，然后采用灰色关联分析法，建立了各成分与药效间的相关性。

在研究以上7种成分对缺氧复氧损伤模型的乳鼠心肌细胞存活率的影响时发现，葛根素对药效结果影响最大，相关系数为0.761 4，表明目前葛根药材质量标准以葛根素作为含量控制指标的科学性与合理性。同时，由灰色关联度分析结果可知，这些成分与药效相关性并无很大差异，相关系数最大值葛根素 （0.761 4）与最小值大豆苷 （0.670 8）之间相差不到0.1，这可能与该类化合物的母核结构一致有关。另外，没有一个化合物表现出明显的药效相关性 （0.9以上），这也从另一角度体现了多组分协同发挥疗效的优势。

本实验成功建立了葛根异黄酮对缺氧复氧损伤心肌细胞保护作用的相关性，初步揭示了葛根发挥疗效的物质基础，也为葛根药材的质量控制、异黄酮类成分治疗冠心病的研究开发与大规模工业化生产提供了科学依据。

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Protective effect of pueraria isoflavones on m yocardial cell with hypoxia/reoxygenation injury

BAO Yong-rui1，2，3， WANG Shuai1，2，3， YANG Xin-xin1，2，3， MENG Xian-sheng1，2，3*， CAILin1
（1.College of Pharmcy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；2.Liaoning Province Multi-component Chinese Medicine Fngineering Technology Research Center，Dalian 116600，China；3.Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Fngineering Laboratory，Dalian 116600，China）

AIMTo establish the HPLC fingerprintof pueraria isoflavones and to analyze the relationship between these constituents and their protective effect on hypoxia/reoxygenation injury myocardial cells.METHODSHPLC-TOF-MSmethod was used to identify the fingerprint of pueraria isoflavones，and ratmyocardial cells with hypoxia/reoxygenation injury were treated with different dosages of these constituents to research their protective effects.The grey correlation analysiswas applied to associating the fingerprint peak areas with cell survival rates.RESULTSSeven peaks from HPLC fingerprint of pueraria isoflavones were found and elucidated as puerarin，3′-hydroxy puerarin，puerarin-xyloside，3′-methoxypuerarin，puerarin-7-wood glycoside，daidzin and isoflavoues aglycone.There was little difference in cell survival rate between the maximum（0.761 4，puerarin）and minimum value（0.670 8，daidzin）.CONCLUSIONThe protective effect of pueraria isoflavones on hypoxia/reoxygenation injurymyocardial cellsmay be due to the synergistic action ofmulti-constituents.

pueraria isoflavones；HPLC；myocardial cells；hypoxia/reoxygenation injury；grey correlation analysis；correlation

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1514-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.025

2014-08-20

十一五 “重大新药创制”科技重大专项项目 （2010ZX09401-304-515）；沈阳市科技计划项目 （F12-146-9-00）

包永睿 （1978—），男，硕士，实验师，从事中药质量分析及作用机制研究工作。Tel：（0411）85890185，E-mail：byr1026 @163.com

*通信作者：孟宪生 （1964—），男，博士，教授，从事中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析工作。Tel： （0411）85890185，E-mail：mxsvvv@126.com