筛选益母草注射液缩宫成分

李 燕， 谢晓芳， 余泉毅， 袁 岸， 陈 蓉， 彭 成

（成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

筛选益母草注射液缩宫成分

李 燕， 谢晓芳*， 余泉毅， 袁 岸， 陈 蓉， 彭 成*

（成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

目的采用大鼠离体子宫筛选益母草注射液 （益母草）缩宫活性成分。方法从益母草注射液中分离到的3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸及总氨基酸作用于大鼠成年雌性未孕和流产的离体子宫并绘制子宫收缩曲线，计算给药前后子宫收缩幅度、频率和活动力的变化。结果益母草注射液、3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸和总氨基酸可明显升高大鼠离体子宫收缩活动力及收缩幅度的最大值、最小值、平均值 （P＜0.05或P＜0.01）。结论益母草注射液中存在兴奋子宫的3个成分中以N-异丁基缬氨酸活性更好。

益母草注射液；缩宫；离体子宫；子宫活动；活性成分

益母草注射液是子宫收缩药，常用于产后子宫修复和产后止血，临床效果显著，现以含有量最多的水苏碱作为质量控制成分，然而，其缩宫止血的主要物质基础是否是水苏碱尚不明了，作用机制亦不清楚。据此，本项目在前期研究中，采用大鼠离体子宫模型筛选出其缩宫作用的活性部位是总生物碱部位，如李丹等［1］报道水溶性生物碱部位是其缩宫的主要部位，然后进一步对此部位进行分离、提纯，得到系列成分。本实验将选择含有量较多、结构明确的两个成分及一个化合物进行缩宫活性筛选，对明确益母草注射液的主要活性物质基础和提高其质量标准有重要意义。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 益母草注射液，由成都第一药业有限公司提供，批号120402，批准文号国药准字Z51021448，规格1 mL/支，用法1～2 mL/次，1～2次/日。益母草注射液不同提取成分3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸及化合物总氨基酸，由成都中医药大学国家重点实验室熊亮博士提供 （每1 g 3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸分别相当于100 g、120 g、50 g生药，用前均按0.2支/mL，即用蒸馏水分别配成0.095、0.08、0.074 g/m L，备用）。缩宫素注射液，由河南辅仁怀庆堂制药有限公司提供，批号1204021；己烯雌酚注射液，由上海通用药业股份有限公司提供，批号081104；米非司酮，由浙江仙琚制药股份有限公司提供，批号120201，用生理盐水配成0.83 mg/mL，备用；米索前列醇，由北京紫竹药业有限公司提供，批号43120S03，用生理盐水配成10μg/mL，备用。氯化钠，批号20121130；氯化钾，批号20120427；碳酸氢钠，批号 20110824；葡萄糖，批号20110331；氯化钙，均由成都市科龙化工试剂公司生产。乐氏液配制方法：取氯化钠9.2 g、氯化钾0.42 g、碳酸氢钠0.15 g、葡萄糖1.0 g溶于生理盐水中至溶解，再加入氯化钙0.24 g，搅匀溶解，配制成1 000 mL，临用前配制。

1.2 动物 SD大鼠，普通级，体质量 （200± 20）g，雌雄比例为2∶1。质量合格证号：SCXK（川）2008-11，检疫后用。动物实验环境：成都中医药大学国家中医药管理局中药药理科研三级实验室（TCM-2009-315）。

1.3 主要仪器 十六道生理记录分析系统、离体组织灌流系统，均由澳大利亚Powerlab公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 对正常大鼠离体子宫收缩活动的影响［2］取健康、成年雌性未孕大鼠，实验前2 d每日腹腔注射己烯雌酚注射液1 mg/kg以造成动情期。于第3天颈椎脱臼处死动物，迅速剖取子宫置于盛有乐氏液的的玻璃皿中，轻轻剥离子宫上附有的结缔组织和脂肪组织。然后取中间段子宫2～3 cm，一端固定于麦氏浴槽，另一端连接张力换能器，并给予一个初始张力1 g的铁环。制备离体子宫标本，将子宫固定于装有乐氏液的离体平滑肌槽中，记录离体子宫肌的收缩活动。麦氏浴槽中营养液保持在（37±0.5）℃，并通以95%氧气和5%二氧化碳的混合气体，速度1～2个小气泡/s，用十六道生理记录分析系统记录子宫收缩曲线 （子宫收缩最大值、最小值、平均值单位计为1）。待曲线稳定30 min，加入益母草注射液，加药后记录10min离体子宫肌收缩活动；换去营养液，冲洗3次，待曲线稳定后，加入1 U/mL缩宫素160μL，10 min后再加入之前相同的益母草注射液剂量，观察离体子宫肌收缩活动的变化。

1.4.2 对流产大鼠离体子宫收缩活动的影响 将大鼠于每日18∶00以雌雄比例2∶1合笼，于次日晨8∶00进行阴道涂片，以显微镜检查发现有精子为妊娠第1天。于第7天按体质量灌胃米非司酮8.3 mg/kg（8∶00）和米索前列醇100μg/kg（18∶00），引起不完全流产，实验时颈椎脱臼处死动物，制备离体子宫标本，将子宫固定于装有乐氏液的离体平滑肌槽中，记录离体子宫肌的收缩活动，之后操作同上。同时，计算各给药组子宫收缩平均值和活动力的抑制率，计算方法为：抑制率=［（给药前-给药后）/给药前］×100%。

对未给缩宫素造模的正常、流产大鼠子宫均分别给予37.5、75、150μL益母草注射液 （空白对照给予150μL生理盐水），10、10、20μL 3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸和总氨基酸；对给予缩宫素造模的大鼠子宫均分别给予150μL益母草注射液 （空白对照给予150μL生理盐水），40μL 3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸和总氨基酸。

1.4.3 数据分析 采用SPSS 19.0统计软件包建立数据库，以配对样本t检验统计分析各指标给药前后的变化，资料以 （x±s）表示。

2 结果

2.1 益母草注射液对正常大鼠离体子宫的影响

2.1.1 对正常大鼠离体子宫收缩活动力的影响

与给药前 （即未给任何药物的子宫）比较，空白对照各剂量子宫收缩活动力均无显著性差异；益母草注射液、N-异丁基缬氨酸中、高剂量，3-羟基吡啶、总氨基酸组高剂量明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前 （即未给任何药物的子宫）比较，造模后 （即给予缩宫素致痉挛的子宫模型）各组子宫收缩活动力均有升高趋势，空白对照、益母草注射液和3-羟基吡啶组明显升高；给药后（即对痉挛子宫给予3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸）空白对照、益母草注射液组明显降低，差异均有统计学意义 （P＜0.05或 P＜0.01）。见图1。

与空白对照组比较，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组低、中、高剂量及给药后子宫收缩活动力、平均值明显升高；益母草注射液组低、中、高剂量明显升高，给药后明显降低。见图2、图3。

图1 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩活动力的影响(x±s,n=10)Fig.1 Influence of Yim ucao Injection on normal rat isolated uterine contraction vitality(x±s,n= 10)

图2 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩活动力的抑制率Fig.2 Inhibition rates of Yimucao In jection on normal rat isolated uterine contraction vitality

图3 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩平均值抑制率Fig.3 Inhibition rates of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine contraction average values

2.1.2 对正常大鼠离体子宫收缩最大值的影响与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩最大值均无显著性差异；益母草注射液组中、高剂量，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组低、中、高剂量均明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩最大值均有升高趋势，3-羟基吡啶、总氨基酸组明显升高；给药后空白对照、益母草注射液组明显降低，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸组明显升高，差异均有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩最大值的影响(x±s,n=10)Fig.4 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine contraction maximum(x±s, n=10)

2.1.3 对正常大鼠离体子宫收缩最小值的影响

与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩最小值均无显著性差异；益母草注射液中、高剂量，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸低、中、高剂量明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩最大值均显著升高；给药后益母草注射液组明显降低，空白对照、3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图5。

图5 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩最小值的影响(x±s,n=10)Fig.5 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine contraction m inimum(x±s,n=10)

2.1.4 对正常大鼠离体子宫收缩平均值的影响

与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩平均值均无显著性差异；益母草注射液、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组低、中、高剂量，3-羟基吡啶中、高剂量明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩平均值均显著升高；给药后空白对照、益母草注射液、3-羟基吡啶、总氨基酸组显著降低，N-异丁基缬氨酸组显著升高，差异均有统计学意义 （P＜0.01）。见图6。

图6 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩平均值的影响(x±s,n=10)Fig.6 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated u terine contraction average values(x± s,n=10)

2.1.5 对正常大鼠离体子宫收缩频率的影响 与给药前比较，空白对照、益母草注射液、3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组低、中、高剂量子宫收缩频率均无明显变化。与造模前比较，造模后各组子宫收缩频率明显升高，给药后益母草注射液组显著降低 （P＜0.01），其他各组无统计学意义。见图7。

图7 益母草注射液对正常大鼠离体子宫收缩频率的影响(x±s,n=10)Fig.7 In fluence of Yimucao Injection on normal rat isolated uterine con traction frequency(x±s, n=10)

2.2 益母草注射液对流产大鼠离体子宫的影响

2.2.1 对流产大鼠离体子宫收缩活动力的影响

与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩活动力均无显著性差异；益母草注射液、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组低、中、高剂量，3-羟基吡啶组中、高剂量明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩活动力明显升高；给药后益母草注射液组明显降低，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组有升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图8。

图8 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩活动力的影响(x±s,n=10)Fig.8 In fluence of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction vitality(x±s,n=10)

与空白对照组比较，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组低、中、高剂量及给药后子宫收缩活动力、平均值明显升高；益母草注射液组低、中、高剂量明显升高，给药后明显降低。见图9～10。

图9 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩活动力的抑制率Fig.9 Inhibition rates of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction vitality

图10 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩平均值的抑制率Fig.10 Inhibition rates of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction average values

2.2.2 对流产大鼠离体子宫收缩最大值的影响

与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩最大值均无显著性差异；益母草注射液、3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸组低、中、高剂量，总氨基酸组高剂量均明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩最大值均有升高趋势，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸组明显升高；给药后空白对照、益母草注射液组明显降低，N-异丁基缬氨酸组明显升高，差异均有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）。见图11。

图11 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩最大值的影响(x±s,n=10)Fig.11 Influence of Yimucao Injection on abortion l rat isolated uterine contraction maximum(x±s, n=10)

2.2.3 对流产大鼠离体子宫收缩最小值的影响

与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩最小值均无明显变化；益母草注射液低、中、高剂量，3-羟基吡啶中、高剂量，总氨基酸组高剂量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩最大值均明显升高；给药后3-羟基吡啶、总氨基酸组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图12。

2.2.4 对流产大鼠离体子宫收缩平均值的影响

与给药前比较，空白对照各剂量子宫收缩平均值均无显著性差异；益母草注射液、总氨基酸低、中、高剂量，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸组高剂量明显升高 （P＜0.05或P＜0.01）。与造模前比较，造模后各组子宫收缩平均值均明显升高；给药后益母草注射液组显著降低，3-羟基吡啶、总氨基酸组明显升高，差异均有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）。见图13。

2.2.5 对流产大鼠离体子宫收缩频率的影响 与给药前比较，益母草注射液组中、高剂量明显升高；与造模前比较，造模后各组子宫收缩频率明显升高，给药后益母草注射液组显著降低 （P＜0.05或P＜0.01），其他各组无统计学意义。见图14。

图12 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩最小值的影响(x±s,n=10)Fig.12 Influence of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction m inim um(x±s, n=10)

图13 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩平均值的影响(x±s,n=10)Fig.13 Influence of Yimucao Injection on abortion rat isolated u terine contraction average values (x±s,n=10)

图14 益母草注射液对流产大鼠离体子宫收缩频率的影响(x±s,n=10)Fig.14 Influence of Yimucao Injection on abortion rat isolated uterine contraction frequency(x±s, n=10)

3 讨论

产后出血是分娩期严重并发症，发病原因主要有子宫收缩乏力、胎盘因素等，其中子宫收缩乏力是导致出血最常见的原因［3］。益母草为传统活血化瘀中药，主要有效成分为益母草碱、水苏碱等多种生物碱，具有活血调瘀、利尿消肿等功效，临床常用于治疗血滞经闭、痛经、产后恶露不尽等症［4］；是治疗妇科症之要药［5］。益母草注射液是成都第一药业有限公司采用中药益母草研究开发的中药新剂型，主要成分是水苏碱［6］，临床常与缩宫素联合使用治疗产后和流产后子宫出血，疗效显著，然而其物质基础不明确。本项目在前期研究基础上，评价由益母草注射液总生物碱提取得到的几种成分的缩宫活性，进一步筛选其缩宫活性成分，评价其缩宫作用，并从成品-粗提物-组分-成分逐层跟踪、揭示其缩宫物质基础。

程永凤［7］研究报道，益母草注射液最主要作用是兴奋离体、在体动物和人子宫，其0.5～1.0 mg/mL对离体子宫平滑肌具有明显的兴奋收缩作用；李毅敏［8］等报道，其能使子宫收缩频率、幅度及张力增加，使子宫不规律的自发性收缩变为有规律的收缩，且收缩幅度增大，可治疗产褥期的子宫收缩不全；周远洋研究报道［9］，其对缩宫素诱发的各种生理状态子宫收缩频率加快和幅度增强具有明显抑制作用，使子宫平滑肌由强直性收缩转为节律性收缩，使张力下降，解除子宫痉挛，即对子宫平滑肌有双向调节作用。本研究结果提示，未给缩宫素致痉挛时，益母草注射液、3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸均可不同程度升高正常和流产大鼠离体子宫的收缩活动力及收缩幅度的最大值、最小值、平均值 （P＜0.05或P＜0.01），主要通过增加子宫收缩活动力、平均值实现，且有随剂量增加而作用增强的量效关系；给予缩宫素致痉挛时，益母草注射液降低，而3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸不同程度升高正常和流产大鼠离体子宫的上述指标，提示，3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸均具缩宫作用，益母草注射液中还存在抑制子宫作用的物质。而上述四者对正常子宫作用较流产子宫明显；3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸、总氨基酸对未给缩宫素致痉挛的正常子宫缩宫作用更佳，分离提取有意义，且N-异丁基缬氨酸较3-羟基吡啶、总氨基酸更明显升高两种离体子宫的上述指标，活性更好。本研究结果与相关文献报道一致。

综上所述，益母草注射液缩宫作用的物质为成分3-羟基吡啶、N-异丁基缬氨酸及化合物总氨基酸且N-异丁基缬氨酸活性更好，几种成分的调控为益母草注射液的制备工艺、质量标准指明了方向，对指导临床合理用药具有重要意义。但益母草注射液中存在的抑制子宫收缩的成分，是否还存在其它缩宫成分，及对在体子宫的影响，均需进一步探讨。

［1］李 丹，谢晓芳，彭 成，等.益母草注射液提取物对流产大鼠离体子宫的影响［J］.药物评价研究，2014，37（1）：21-24.

［2］徐叔云，陈 修，卞如濂.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2002：1582.

［3］刘廷莲.益母草注射液在预防产时产后出血中的疗效观察［J］.保健医学研究与实践，2009，6（3）：36-43.

［4］黎耀东，贾 芸，卢 军.品种、产地及采收期对野生益母草中生物碱成分的影响［J］.中成药，2011，33（10）：1764-1767.

［5］文 娟，杨 蕾，吴大蓉，等.益母草注射液的毛细管电泳指纹图谱研究［J］.中草药，2007，38（8）：1171-1174.

［6］王 莉，郭立新.益母草注射液与缩宫素联合应用预防产后出血的临床观察［J］.中国临床医生杂志，2008，36（5）：41-42.

［7］程永凤.益母草碱和水苏碱单用或合用的药理研究［D］.安徽：安徽医科大学，2010：1-55.

［8］李毅敏，周连发，王士贤.复方益母草膏治疗痛经药理机制的实验研究［J］.中成药，2004，26（4）：311-314.

［9］陈刘庆.益母草药理作用及临床应用研究进展［J］.中国社区医师，2012，14（34）：41.

Screen of oxytocin ingredients from Yim ucao Injection

LIYan， XIE Xiao-fang*， YU Quan-yi， YUAN An， CHEN Rong， PENG Cheng*

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Sichuan Province and Ministry of Science and Technology，Chengdu 611137，China）

AIMTo identify the oxytocic ingredients from Yimucao Injection（Leonurus japonicus Houtt.）.METHODSThe isolated uterus of normal and aborted adult ratswere treated with 3-hydroxypyridine，N-isobutylvaline and total amino acids，all isolated from Yimucao Injection.Their uterine contraction curves were recorded. The changes of uterine contraction amplitude，frequency and vitality before and after administration were observed.RESULTSYimucao Injection，3-hydroxypyridine，N-isobutylvaline and total amino acids could significantly increase rat uterine contraction vitality，maximum，minimum and average values of contraction amplitude（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONN-isobutylvaline achieves the best active effect among three kinds of oxytocic ingredients in Yimucao Injection.

Yimucao Injection；uterine contraction；isolated uterus；uterine activity；active ingredients

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1416-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.006

2014-08-15

国家自然基金项目 （81303209）；四川省应用基础研究项目 （2012JYZ005）；成都中医药大学科技发展基金重点项目（2013）；大学生科研实践创新课题 （ky2014-020）

李 燕 （1990—），女，博生生，研究方向为中药物质基础以及药动学。Tel：15928979634，E-mail：993603736@qq.com

*通信作者：谢晓芳，女，讲师，医学博士，研究方向为中药药理。Tel：13980522864，E-mail：55091620@qq.com彭 成，男，教授，博士生导师，研究方向为疾病动物模型与中药复方。Tel：（028）61800018，E-mail：pengchengcao@ 126.com