筛选大叶蛇葡萄体外抗肿瘤活性物质

桂 春， 黄 静， 程佩佩， 方 玉， 夏 叶， 张秀桥

（湖北中医药大学药学院，湖北武汉430000）

筛选大叶蛇葡萄体外抗肿瘤活性物质

桂 春， 黄 静， 程佩佩， 方 玉， 夏 叶， 张秀桥*

（湖北中医药大学药学院，湖北武汉430000）

目的研究大叶蛇葡萄提取物对HeLa细胞增殖的影响，筛选有效抗肿瘤活性物质。方法采用MTT法检测不同质量浓度的大叶蛇葡萄石油醚、乙酸乙酯及水层萃取物和蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷、槲皮素及槲皮苷分别作用于HeLa细胞24、48、72 h后对细胞增殖的抑制作用。流式细胞仪检测蛇葡萄素对细胞周期的影响。结果乙酸乙酯萃取物、蛇葡萄素和杨梅素均有不同程度抑制HeLa细胞增殖的作用，且在一定剂量范围内，具有时效或量效关系；碘化丙啶单染法显示蛇葡萄素作用HeLa细胞12 h，G0/G1期细胞比率降低，S期细胞比率增加。结论乙酸乙酯提取物、蛇葡萄素和杨梅素对HeLa细胞增殖有明显抑制作用，且蛇葡萄素可能通过阻滞HeLa细胞于S期而诱导细胞凋亡。

大叶蛇葡萄；蛇葡萄素；杨梅素；抗肿瘤；HeLa细胞；细胞增殖；细胞周期

大叶蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et. Gilg是葡萄科蛇葡萄属植物，湖北西部地区民间常用中草药。其药用部位是叶及嫩茎，因其嫩枝叶置沸水中稍烫后，捞起后通风处吹干，表面会出现星点白霜，故又称为霉茶［1］。该药曾收载于 《湖北中草药志》［2］，性平，味酸、涩，具有活血散瘀、止血、清热解毒等功效。现代药理学研究表明其具有降血脂、降血糖、降血压、抗病毒等［3-7］作用，但未见其对抗肿瘤作用的研究报道。

本实验采用MTT［8-10］法观察大叶蛇葡萄3种不同提取物对HeLa细胞增殖抑制情况，分析不同提取物对肿瘤细胞的影响。实验结果提示乙酸乙酯萃取物对HeLa细胞的增殖有较好的抑制作用，进而将从乙酸乙酯萃取物分离得到的蛇葡萄素等5种化合物分别采用MTT法观察其对HeLa细胞的抑制作用，并将抑制作用最强的蛇葡萄素进行细胞周期分布的研究，初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 材料

1.1.1 药品和细胞株 大叶蛇葡萄采于湖北省恩施州来凤县，经湖北中医药大学生药学教研室张秀桥教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡萄Ampelopsismegalophylla Diels et.Gilg，取其叶及嫩茎为实验材料。实验所用宫颈癌细胞HeLa购于中国典型培养物保藏中心，在武汉大学药学院细胞室传代备用。

1.1.2 试剂 四甲基偶氮唑盐粉末（MTT，美国Amresco公司），DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素-链霉素 （双抗）、胰蛋白酶 （美国Thermo公司），小牛血清 （NBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），二甲基亚砜 （DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）粉末（美国Sigma公司）。

1.1.3 大叶蛇葡萄提取物的分离与溶液制备 称取大叶蛇葡萄药材8.5 kg，粉碎，过10目筛，分别以10倍量95%和75%乙醇各渗漉提取一次 （浸泡24 h，体积流量10 mL/min），合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至小体积得乙醇提取物；加适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和水进行萃取，分别合并3种不同萃取液，最后依次浓缩干燥得到石油醚、乙酸乙酯及水层提取物。取乙酸乙酯提取物200 g采用硅胶柱、Sephadex LH-20柱色谱等技术分离纯化，分别得到蛇葡萄素、杨梅素、杨梅苷、槲皮素和槲皮苷。称取适量的提取物，用DMSO配成适当浓度的供试液，4℃冰箱保存，实验时用培养基稀释成所需药物浓度，提取物质量浓度分别为12.5、25、50、100、200μg/mL，单体的摩尔浓度为20、40、80、160、320μmol/L。

1.1.4 实验仪器 Galaxy s+CO2培养箱（英国RSBiotech公司）；ClassⅡtype A2超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；IX51Olympus倒置显微镜（日本Olympus公司）；HEV-50自动高压灭菌器（日本Hirayama公司）；iMark酶标仪（美国Bio-RAD公司）；TDZ4-WS台式自动平衡离心机 （长沙平凡仪器仪表有限公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；BCD-188C冰箱（合肥美菱股份有限公司）；WG-136电热鼓风干燥箱 （天津市泰斯特仪器有限公司）。

2 实验部分

2.1 细胞培养 HeLa细胞采用DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，用0.25%的胰酶消化传代，用于实验的细胞均处于对数生长期。

2.2 MTT法测定HeLa细胞的生长抑制率 选择处于对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞计数为5×103个/mL接种于96孔板，每孔100μL，然后将培养板置37℃、5%CO2培养箱中24 h后，吸取旧培养液，每孔加入100μL的药液，每个浓度设置3个复孔，并设置空白对照组（含细胞、培养基及溶剂）和调零组 （含培养基和溶剂）。分别在培养箱温孵24、48、72 h后，每孔加入20μLMTT溶液，继续放入37℃、5%CO2培养箱培养。4 h后吸去上清液，加入100μL的DMSO，放置于摇床上低速振荡至每孔中结晶物完全溶解。在酶标仪490 nm波长处测量各孔吸光度（OD）。实验重复3遍。

2.3 PI单染法检测HeLa细胞周期 选择对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞计数为2×105个/mL接种于6孔板，每孔2 mL。培养24 h后，分别加入 0、30、40、50、60、70 μmol/L的蛇葡萄素药液，12 h后收集细胞。离心后用预冷的PBS洗涤2次后，加入75%乙醇放置-20℃环境固定过夜，离心后PBS洗涤2次，加入30μL 1 mg/mL RnaseA，37℃作用30 min，加入50μg/m L的PI溶液，4℃避光染色30 min用流式细胞仪检测，细胞周期拟和软件分析结果［11-13］。

2.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果用x±s表示，与对照组比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义，同时计算半数抑制率 （IC50）值。

3 结果及分析

3.1 提取物对HeLa细胞的生长抑制作用 一定浓度范围内，3种提取物分别作用于HeLa细胞24、48和72 h。结果显示当药物作用时间为48 h时，在25～200μg/mL范围内，石油醚提取物对HeLa细胞的抑制作用随质量浓度的升高而增强，表现剂量依赖性；当药物作用时间为72 h时，在12.5～200μg/mL范围内，石油醚提取物对HeLa细胞的抑制作用随质量浓度的升高而增强，表现剂量依赖性。如图1A所示。当药物作用时间为48 h时，在12.5～200μg/mL范围内，乙酸乙酯提取物对HeLa细胞的抑制作用随质量浓度的升高而增强，表现剂量依赖性；当药物质量浓度为50μg/mL时，乙酸乙酯提取物对HeLa细胞的作用随时间的延长而减弱，表现时间依赖性，即当药物作用时间为24 h，抑制作用最强。结果见图1B。HeLa细胞对水层提取物不敏感，结果见图1C。

图1 石油醚、乙酸乙酯、水层提取物对HeLa细胞抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ether,EtOAc,aqueous extract on cell proliferation in HeLa

3.2 单体化合物对HeLa细胞的生长抑制作用

一定浓度范围内，5种化合物分别作用于HeLa细胞24、48和72 h后，对细胞增殖的抑制作用结果如图2～6所示。

图2 蛇葡萄素对HeLa细胞抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of am pelopsin on cell proliferation in HeLa

图3 杨梅素对HeLa细胞抑制作用Fig.3 Inhibitory effect ofm yricetin on cell proliferation in HeLa

图4 杨梅苷对HeLa细胞抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of m yricetrin on cell proliferation in HeLa

图5 槲皮素对HeLa细胞抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of quercetin on cell p roliferation in HeLa

图6 槲皮苷对HeLa细胞抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of quercetrin on cell proliferation in HeLa

当药物作用48 h，在20～320μmol/L范围内，蛇葡萄素对细胞的抑制作用随浓度的升高而增强，表现剂量依赖性；当药物作用72 h，在40～320μmol/L范围内，蛇葡萄素对细胞的抑制作用随剂量的升高而增强，表现剂量依赖性；当药物浓度分别为80、160和320μmol/L时，蛇葡萄素对He-La细胞增殖的抑制作用均随时间的延长而增强，分别表现时间依赖性；即当药物作用时间为72 h时，蛇葡萄素对HeLa细胞增殖的抑制作用最强，如图2所示。经计算得蛇葡萄素作用HeLa细胞24、48和72 h的 IC50分别为105.30、90.55和65.58μmol/L。

当药物作用48 h，在40～320μmol/L范围内，杨梅素对HeLa细胞的抑制作用随浓度的升高而增强，表现剂量依赖性；当药物浓度分别为80、160和320μmol/L时，杨梅素对HeLa细胞增殖的抑制作用均随时间的延长而增强，表现时间依赖性；即当药物作用时间为72 h时，杨梅素对HeLa细胞增殖的抑制作用最强，如图3所示。计算得杨梅素作用HeLa细胞24、48和72 h的IC50分别为108.15、93.06和85.44μmol/L。

由图4可知，当药物作用48或72 h，在20～160μmol/L范围内，杨梅苷对HeLa细胞几乎无抑制作用，当药物剂量逐渐升高至320μmol/L过程呈现一定的抑制作用。

当药物作用24或48 h，在40～320μmol/L范围内，槲皮素对细胞的抑制作用随浓度的增高而增强，表现剂量依赖性；当药物作用72 h，在20～320μmol/L范围内，槲皮素对细胞的抑制作用随浓度量的增高而增强，表现时间依赖性；如图5所示。经计算得槲皮素作用HeLa细胞48和72 h的IC50分别为229.38和158.9μmol/L。

由图6可知，HeLa细胞对槲皮苷不敏感。

3.3 蛇葡萄素对HeLa细胞周期分布的影响 流式细胞仪检测不同浓度的蛇葡萄素作用HeLa细胞的DNA水平揭示了HeLa细胞周期分布的变化。如图7所示，与空白对照组对照可知，G0/G1期，给药组的DNA水平随着药物剂量的升高逐渐降低；S期，给药组的DNA水平呈现升高趋势；G2/M期，在30～60μmol/L范围内，给药组DNA水平随着药物剂量的升高逐渐增大，当浓度为70μmol/L，DNA水平减小。由此可知，高浓度时细胞凋亡较多，蛇葡萄素可能造成HeLa细胞S期阻滞，从而影响细胞周期正常进行。

4 讨论

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一［14］，在全球女性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌［15］，它的发病和死亡的85%以上是在发展中国家［16］。作为发展中国家，2010年我国宫颈癌病例 27 000～130 000例，若没有进行任何干预措施，到2050年可能增加到42 000～187 000例［17］。由此可见，对宫颈癌的有效治疗对女性健康的必要性和重要性。随着现代社会的肿瘤患者的增多，西药治疗疗效相对明显，但伴随毒副作用，且久用会产生耐药性，而人们对身体的重视程度却在不断提高。我国中药资源丰富，种类繁多，在治疗肿瘤方面积累了宝贵的经验，因此从中筛选出高效低毒的抗宫颈癌药物具有广阔前景。

本实验针对此问题，选取宫劲癌HeLa细胞对大叶蛇葡萄的抗肿瘤活性进行了系列研究。根据图1比较可知，水层提取物对HeLa细胞几乎无抑制作用，其他两种提取物在一定剂量、时间范围内都表现相对的抑制作用。

当药物作用时间为24 h时，在12.5～200 μg/mL范围内，石油醚提取物对HeLa细胞无抑制作用，乙酸乙酯提取物对HeLa细胞抑制作用呈加强趋势，且抑制作用较强；当药物作用时间为48或72 h时，石油醚提取物对HeLa细胞抑制作用随剂量的升高而加强，但只在最高剂量时抑制率达到半数抑制率，而乙酸乙酯提取物对HeLa细胞抑制作用随剂量的升高而加强，且抑制作用最高达90.65%。

图7 蛇葡萄素对HeLa细胞周期分布的影响Fig.7 Effect of ampelopsin on cell cycle distribution in HeLa

当药物质量浓度为25μg/mL时，乙酸乙酯提取物对HeLa细胞作用24 h时的抑制作用明显强于石油醚提取物，且抑制率为68.20%；当药物质量浓度为50μg/m L时，乙酸乙酯提取物对HeLa细胞作用24 h的抑制作用亦明显高于石油醚提取物，抑制率为73.64%；由此可见，3种提取物中，乙酸乙酯提取物对HeLa细胞的抑制作用最强，且通过计算最强IC50为28.55μg/mL。

根据图7可知，HeLa细胞对槲皮苷不敏感，杨梅苷与槲皮素在高浓度时表现一定的抑制作用，相比较可知蛇葡萄素与杨梅素对HeLa细胞的抑制作用较强，且在一定的剂量、时间范围内呈现时间-剂量效应关系。

当药物作用时间为72 h，蛇葡萄素和杨梅素均得到最低IC50值，分别为65.58和85.44μmol/L。当药物浓度为40μmol/L时，蛇葡萄素对HeLa细胞的抑制率为20.96%，而杨梅素对HeLa细胞生长表现促进作用；当药物浓度为80μmol/L时，蛇葡萄素和杨梅素对HeLa细胞的抑制率分别为84.53和61.15%，前者抑制作用强于后者；当药物浓度继续升高，此两种药物对HeLa细胞生长的抑制作用变化不明显。由此可见，5种化合物中，蛇葡萄素对HeLa细胞的抑制作用最强，且通过计算最强的IC50为65.58μmol/L。

本研究中首先对大叶蛇葡萄的3种提取物进行抗宫颈癌的活性筛选，发现乙酸乙酯提取物具有较强的抑制作用，且在一定剂量、时间范围内，有良好的时间-剂量效应关系。进一步对从乙酸乙酯提取物分离得到的五种单体同样进行了抗宫颈癌活性筛选，发现蛇葡萄素与杨梅素对HeLa细胞增殖有较强的抑制作用，最小IC50分别为65.58和85.44 μmol/L，因蛇葡萄素作为大叶蛇葡萄含有量最高的主要活性成分，且对HeLa细胞的IC50小于杨梅素，故选取蛇葡萄素作为代表物质进行下一步的细胞周期实验表明，结果表明蛇葡萄素可能通过阻滞HeLa细胞于S期而诱导其凋亡，该研究为后期大叶蛇葡萄抗肿瘤作用机制的研究奠定了基础，同时也为研制抗宫颈癌现代新药提供了新方向。

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Screen of anti-tumor active substances in vitro from Ampelopsismegalophylla

GUIChun， HUANG Jing， CHENG Pei-pei， FANG Yu， XIA Ye， ZHANG Xiu-qiao*
（School of Pharmaceutical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，PR China）

AIMTo investigate the inhibitory effect of extracts from Ampelopsismegalophylla on the proliferation of HeLa cells and to screen the anti-tumor activity in vitro.METHODSHeLa cellswere treated with ether，EtOAc and aqueous extracts of A.megalophylla as well as five compounds，ampelopsin，myricetin，myricetrin，quercetin and quercetrin，with various concentrations，respectively.MTTmethod was used to evaluate the inhibitory efficiency in 24 h，48 h and 72 h，respectively.Flow cytometry PIwas used tomeasure their changes of cell cycle under the condition of ampelopsin.RESULTSExperimental data showed EtOAc extract，ampelopsin and myricetin all inhibited the cell proliferation in a dose-effector time-effect relationship within a certain concentration range.Propidium iodide（PI）stainingmethod indicated that there were less cells at G0/G1stage andmore cells arrested at S stagewhen incubated with ampelopsin.CONCLUSIONEtOAc extract of A.megalophylla，ampelopsin andmyricetin can inhibit the human cervical cancer cell line HeLa in vitro by inhibiting cellproliferation.Maybe ampelopsin induces cell apoptosis by arresting cells at Sphase.

Ampelopsismegalophylla；ampelopsin；myricetin；anti-tumor；HeLa cells；cell proliferation；cell cycle

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1411-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.005

2014-08-18

国家自然科学基金项目 （31170335）；武汉市重点科技攻关计划项目 （201160823265）

桂 春 （1989—），女，硕士，从事中药资源、品质及开发研究。Tel：15927207749，E-mail：gc19890703@163.com

*通信作者：张秀桥 （1965—），女，博士，教授，博士生导师，从事中药资源、品质及开发研究。Tel：13871392318，E-mail：qiaoxzh2000@163.com