乳腺消郁颗粒的质量控制

朱冬可， 吴佩颖，*， 高 崎， 顾慧芬，

（1.上海中医药大学，上海201203；2.上海杏灵科技药业股份有限公司，上海201703）

乳腺消郁颗粒的质量控制

朱冬可1， 吴佩颖1，2*， 高 崎2， 顾慧芬2，

（1.上海中医药大学，上海201203；2.上海杏灵科技药业股份有限公司，上海201703）

目的建立乳腺消郁颗粒的质量控制方法。方法采用HPLC法测定乳腺消郁颗粒中芍药苷和松果菊苷含有量，同时对其中的川芎、当归、淫羊藿、锁阳药材进行薄层色谱鉴别。结果HPLC法测出芍药苷和松果菊苷分别在31.55～631mg/L（r=0.999 9）和9.95～298.5mg/L（r=0.999 9）范围内与峰面积有良好的线性关系，平均加样回收率分别为100.09%（RSD=0.71%）和100.59%（RSD=1.14%）。同时，薄层色谱中检出了川芎、当归、淫羊藿、锁阳的特征斑点。结论该方法重复性好、简便、快速，能够有效控制乳腺消郁颗粒的质量。

乳腺消郁颗粒；HPLC法；薄层色谱法；质量控制

乳腺小叶增生在中医上属于 “乳癖”范畴，产生因素有很多。中医理论认为，肝肾同源，肝藏血，肾藏精，肝疏泄功能失常，气机失调，以及肾的先天和后天之精不足，发育不良，最终导致乳腺小叶增生［1］。现代研究表明，情志内伤、冲任失调、劳累过度或体内雌激素分泌失调等都可能引发该病［2-3］。传统中医主要以疏肝解郁、行气化痰、调理冲任、活血通络、消癥散结为治疗方法［2］。乳腺消郁颗粒是上海市黄浦区中心医院的医院制剂，对治疗女性乳房疾病有很好的疗效，主要功能为疏肝消郁，调摄冲任，用于治疗乳房胀痛和小叶增生，由赤芍、肉苁蓉、川芎、当归、淫羊藿、锁阳等12味药组成。赤芍和肉苁蓉散瘀止痛，温补肾阳，起主要作用；川芎和当归活血行气，调经止痛，淫羊藿和锁阳温补肾阳，起辅佐作用。但现有标准以定性鉴别为主，无定量测定，专属性不强。为了更有效控制乳腺消郁颗粒的质量及疗效，本实验采用高效液相色谱法测定其中赤芍所含的芍药苷及肉苁蓉所含的松果菊苷含有量，并应用薄层色谱法对其中川芎、当归、淫羊藿、锁阳药材进行鉴别，以期提高乳腺消郁颗粒质量控制方法，保证临床疗效。

1 仪器和试药

Waters1525-2487高效液相色谱仪系统（美国Waters公司）；DC-200H超声波清洗仪 （东莞市塘厦昆圣超声波机械加工厂）；BS 110S电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）。乳腺消郁颗粒 （上海杏灵科技药业股份有限公司，批号分别为130801、130802、130803）；芍药苷对照品（批号110736-201337）、松果菊苷 （批号111670-200503）、熊果酸 （批号111742-200517）、淫羊藿苷 （批号1110737-200312），川芎对照药 （批号120918-201110）、当归 （批号120927-201014）、淫羊藿 （批号121032-200501），均购自中国食品药品检定研究院。乙酸乙酯、乙醚、甲苯、丁酮、甲酸、正己烷均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司），甲醇为色谱纯 （德国Merck公司）。

2 薄层色谱鉴别

2.1 川芎、当归药材薄层色谱鉴别 取本品3批和缺川芎、当归药材的阴性样品各2包 （约24 g），加水200 mL溶解，乙醚萃取3次，每次150 mL，合并萃取液，浓缩蒸干，残渣加乙醚3mL溶解，作为供试品溶液和阴性样品溶液；取川芎0.1 g，当归0.1 g，分别加乙醚15 mL溶解，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙醚1 m L溶解，作为对照药材溶液。按照薄层色谱法 （《中国药典》2010年版一部附录VIB），吸取供试品溶液和阴性样品溶液10μL以及对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯 （4∶1）为展开剂［4］展开，取出后晾干，置紫外光灯 （365 nm）下检视。结果表明，在相应的位置上，供试品色谱在与对照药材显示出相同颜色的荧光斑点，且阴性样品无干扰，见图1。

2.2 淫羊藿药材薄层色谱鉴别 取本品3批和缺淫羊藿药材阴性样品各2包 （约24 g），充分研磨，加乙醇240 mL，50℃水浴温浸30 min，滤过，蒸干，加乙醇3 mL溶解，作为供试品溶液和阴性样品溶液；取淫羊藿药材粉末0.1 g，加乙醇10 mL溶解，50℃水浴温浸30 min，滤过，蒸干，加乙醇3 mL溶解，作为对照药材溶液；精密称取淫羊藿苷5mg，置于50mL量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，即得质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法 （《中国药典》2010年版一部附录VIB），吸取10μL供试品溶液和阴性样品溶液、20μL对照药材溶液、20μL对照品溶液，分别点于硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 （10∶1∶1∶1）为展开剂展开［4］，置紫外灯 （365 nm）下检视。结果表明，在相应的位置上，供试品色谱与对照品显示出相同的暗红色斑点，然后喷以三氯化铝试液再进行检视，结果显示出相同的橙红色荧光斑点，且阴性样品无干扰，见图2。

图1 当归、川芎药材的TLC

图2 淫羊藿药材的TLC

2.3 锁阳药材薄层色谱鉴别 取本品3批和缺锁阳药材阴性样品各2包 （约24 g），充分研磨，加乙酸乙酯240 mL溶解，超声30 min，滤过，滤液蒸干，加乙酸乙酯3 mL溶解，作为供试品溶液和阴性样品溶液；精密称取熊果酸对照品5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，即得质量浓度为0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法 （《中国药典》2010年版，一部附录VIB），吸取20μL供试品溶液和阴性样品溶液、10μL对照品溶液，分别点于硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂展开［4］，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至显紫红色斑点。结果表明，在相应的位置上，供试品色谱与对照品显示出相同的紫红色斑点，且阴性样品无干扰，见图3。

3 两种成分的HPLC测定

3.1 芍药苷测定

图3 锁阳药材的TLC

3.1.1 对照品溶液的配制 精密称取芍药苷对照品12.62 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度为0.631 mg/mL的芍药苷对照品溶液。3.1.2 供试品溶液和阴性样品溶液的配制 取本品粉末和缺赤芍药材阴性对照各1 g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL溶解，称定质量，超声20min，放冷后用甲醇补足损失质量，再用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液和缺赤芍阴性对照溶液。

3.1.3 色谱条件［4-5］Alltima C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱温35℃，体积流量1 mL/min，进样量10 μL。以甲醇-0.05%醋酸 （23∶77）为流动相，检测波长230 nm。

3.1.4 专属性试验 取阴性样品溶液，按照 “3.1.3”项下色谱条件测定。结果发现，缺赤芍药材样品在相应出峰时间处没有出峰，说明该方法专属性良好，见图4。

3.1.5 线性关系的考察 分别精密量取 “3.1.1”项下芍药苷对照品溶液0.25、0.5、1、2、3、4、5mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度线，摇匀，得到不同质量浓度的对照品溶液，按照 “3.1.3”项下色谱条件测定，记录色谱图。绘制芍药苷质量浓度 （X）和峰面积 （Y）的标准曲线，计算回归方程为Y=1.321×107X-18 807，r= 0.999 9。结果表明，芍药苷在31.55～631 mg/L范围内线性关系良好。

3.1.6 精密度试验 按 “3.1.3”项下色谱条件，精密称取批号为130801样品1份，按 “3.1.2”项方法制备成供试液，连续进样6次，测定芍药苷峰面积，RSD为0.16%，表明精密度良好。

3.1.7 重复性试验 精密称取批号为130801样品6份，按 “3.1.2”项方法制备成供试液，按 “3.1.3”项下色谱条件测定芍药苷量。结果测得平均值为2.228 mg/g，RSD为1.07% （n=6），表明重复性良好。

3.1.8 稳定性试验 精密称取批号为130801样品1份，按 “3.1.2”项方法制备成供试液，在常温下放置24 h，按“3.1.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，测定芍药苷峰面积，RSD为0.28%，表明供试液在12 h内稳定。

图4 芍药苷对照品 （A）、供试品 （B）与阴性样品（C）HLPC色谱图

3.1.9 加样回收率试验 精密称取批号为130801的乳腺消郁颗粒各6份，每份1 g，分别精密加入质量浓度为0.409 mg/m L的芍药苷对照品溶液5 mL，按“3.1.2”项方法操作，即得待测溶液。按 “3.1.3”项下色谱条件测定，结果见表1。

表1 乳腺消郁颗粒中芍药苷加样回收率试验结果

3.1.10 样品测定 取3批样品，按 “3.1.2”项下方法操作，供试品溶液按 “3.1.3”项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标一点法测定乳腺消郁颗粒中芍药苷，结果见表2。

3.2 松果菊苷测定

3.2.1 对照品溶液的配制 精密称取松果菊苷对照品9.95 mg，置于20mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解，稀释至刻度线，摇匀，即得质量浓度为0.497 5 mg/mL的松果菊苷对照品溶液。

表2 乳腺消郁颗粒样品中芍药苷测定结果

3.2.2 供试品溶液和阴性样品溶液的配制 取本品粉末和缺肉苁蓉药材阴性对照品各1 g，置于具塞锥形瓶中，加50%甲醇50 mL溶解，称定质量，超声40 m in，放冷后用50%甲醇补足损失质量，再用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液和缺肉苁蓉阴性对照溶液。

3.2.3 色谱条件［4］Alltima C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），柱温35℃，体积流量1 mL/min，进样量10 μL。以甲醇-0.1%甲酸 （29∶71）为流动相，检测波长334 nm。

3.2.4 专属性试验 取阴性样品溶液，按照 “3.2.3”项下色谱条件测定。结果发现，缺肉苁蓉药材样品在相应出峰时间处没有出峰，说明该方法专属性良好，见图5。

图5 松果菊苷对照品 （D）、供试品 （E）与阴性样品（F）HLPC色谱图

3.2.5 线性关系的考察 分别精密量取 “3.2.1”项下松果菊苷照品溶液0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，置于5mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度线，摇匀，得到不同质量浓度的对照品溶液，按照 “3.2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图。绘制松果菊苷质量浓度 （X）和峰面积 （Y）的标准曲线，计算回归方程为Y=1.316×107X-5 763.8，r=0.999 9，表明松果菊苷在9.95～298.5 mg/L范围内线性良好。

3.2.6 精密度试验 按 “3.2.3”项下色谱条件，精密称取批号为130801样品1份，按 “3.2.2”项制备成供试液，连续进样6次，测得松果菊苷峰面积，RSD为0.97%，表明精密度良好。

3.2.7 重复性试验 精密称取批号为130801样品6份，按 “3.2.2”项制备成供试液，按 “3.2.3”项下色谱条件测定松果菊苷量。结果测得平均值为4.472 mg/g，RSD为0.43%（n=6），表明重复性良好。

3.2.8 稳定性试验 精密称取批号为130801样品1份，按 “3.2.2”项制备成供试液，在常温下放置24 h，按“3.2.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，测得松果菊苷峰面积，RSD为1.36%，表明供试液在12 h内稳定。

3.2.9 加样回收率试验 精密称取批号为130801的乳腺消郁颗粒各6份，每份1 g，分别精密加入质量浓度为0.607 6 mg/mL的松果菊苷对照品溶液7.5 mL，按“3.2.2”项方法操作，即得待测溶液。按 “3.2.3”项下色谱条件测定，结果见表3。

表3 乳腺消郁颗粒中松果菊苷加样回收率试验结果

3.2.10 样品测定 取3批样品，按 “3.2.2”项下方法操作，供试品溶液按 “3.2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图，按外标一点法测定乳腺消郁颗粒中松果菊苷，结果见表4。

表4 乳腺消郁颗粒样品中松果菊苷测定结果

4 结论及讨论

赤芍为毛茛科多年生草本植物芍药或川赤芍的根，具有清热凉血，散瘀止痛之功效。有资料表明［6］，大剂量赤芍对治疗急性乳腺炎有很好的疗效。芍药苷是芍药中的主要有效成分之一，是一种单萜类糖苷化合物。近年来，研究人员对其展开了一系列深入的研究，发现它具有多种药理作用，且毒副作用小。殷天照等报道［7］，在中药配伍中如果芍药苷煎出量高，则治疗乳腺增生效果较好。 《本草汇言》中记述，肉苁蓉是 “养命门，滋肾气，补精血之药也。妇人冲任失调而阴气不治，此乃平补之剂……”。现代研究发现［8］，肉苁蓉中含有雄性激素样作用活性成分，可以调节体内激素水平［9］。另外，松果菊苷在 《中国药典》2010年版中作为控制肉苁蓉质量的有效成分。因此，把芍药苷和松果菊苷作为本实验中的活性成分测定指标来进行研究更具代表性，能够更好地控制药物的疗效。

芍药苷的前处理实验比较了以甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇为溶剂，进行超声提取。结果表明，采用甲醇为提取溶剂时，提取完全，操作方便，检测时杂质峰少。同时，还以甲醇为提取溶剂，分别超声20、30、40 min，检测同一批号中芍药苷含有量，发现超声20 min时，不但所需时间短，而且提取完全。

芍药苷的分离试验中，根据文献［4-5，10-12］报道，分别采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸作为流动相进行考察，同时结合生产检测需要，选择成本低、效率高、分离效果好的流动相。结果表明，甲醇-0.05%醋酸峰型和分离度理想，经优化后最终确定流动相为甲醇-0.05%醋酸 （23∶77）。

松果菊苷的分离试验中，采用甲醇-0.1%甲酸 （29∶71）等度洗脱，不仅出峰时间短，效率高，而且分离效果好。

薄层色谱鉴别中，对起主要疗效的有效成分当归、川芎、淫羊藿、锁阳进行了薄层色谱鉴别。结果表明，色谱斑点清晰，方法重复性好，而且阴性对照无干扰。

综上所述，本实验方法可以作为乳腺消郁颗粒清膏、半成品、颗粒的质量控制手段，能够有效控制其在生产过程中的质量，并且操作简便，重复性好。

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：1001-1528（2015）06-1375-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.051

2014-09-11

朱冬可（1989—），女，硕士，研究方向为中药制药新技术研究。E-mail：zhudongke.123@163.com

*通信作者：吴佩颖（1961—），男，教授，研究方向为中药制药新技术研究及其产业化。E-mail：wupeiyingsh@163.com