麝香保心丸对心力衰竭大鼠心肌重构及缝隙连接蛋白Cx43和Cx45的影响

吴志雄， 江振涛， 罗 健， 周松柏， 肖 婷， 李 芳， 杨 军

（南华大学附属第一医院心血管内科，湖南衡阳421001）

麝香保心丸对心力衰竭大鼠心肌重构及缝隙连接蛋白Cx43和Cx45的影响

吴志雄， 江振涛， 罗 健， 周松柏， 肖 婷， 李 芳， 杨 军*

（南华大学附属第一医院心血管内科，湖南衡阳421001）

目的观察麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pills，SBP）对压力超负荷所致心力衰竭大鼠的心肌重构及缝隙连接蛋白Cx43和Cx45表达的影响。方法取雄性SD大鼠30只，随机分为假手术组 （SO组）、心力衰竭模型组 （HF组）、心力衰竭模型+麝香保心丸组 （HS组），各10只。采用腹主动脉缩窄法建立大鼠心力衰竭模型，HS组以麝香保心丸 （15mg/kg，1天2次）灌胃，而HF组和SO组则用生理盐水替代。12周后进行心脏B超检查，处死大鼠，取出左心室肌组织，HE染色观察心肌形态结构，Western blot检测Cx43和Cx45在左室心肌组织的表达。结果心脏B超显示，与SO组比较，HF组左室舒张末内径显著增加，EF（射血分数）值下降；HS组左室舒张末内径减少，EF值增加。HE染色显示，HS组与HF组相比，心肌细胞排列紊乱明显改善；Western blot显示，HF组Cx43表达明显减少，但Cx45表达没有明显变化；HS组Cx43表达明显上调。结论SBP可以改善心力衰竭大鼠的心肌重构，改善缝隙连接蛋白Cx43表达的下调。

麝香保心丸；心肌细胞；Cx43；Cx45；心肌重构

心力衰竭是大多数心血管疾病的终末期表现和主要死因。心肌重构是心力衰竭发生发展的基本病理机制，心肌重构不仅引起心功能障碍，而且是各种心律失常发生的基质，所以心力衰竭时更容易并发心律失常和猝死。缝隙连接重构不仅与心力衰竭时的结构重构密切相关，也是心力衰竭时电生理重构的重要组成部分。缝隙连接 （gap junc-tion，GJ）是相邻心肌细胞间电化学偶联的通道，其中Cx43是心室肌表达的最主要缝隙连接蛋白 （Connexin，Cx）［1］，而心室肌内同时还存在Cx45。缝隙连接蛋白表达的异常可能影响缝隙连接电荷耦联和代谢耦联的功能导致心律失常的发生。麝香保心丸已证实具有扩张冠状动脉、保护血管内皮细胞、促进血管新生及抗心肌纤维化等作用［2］。临床上也发现麝香保心丸对早搏、房颤、慢性心律失常也具有一定的疗效［3］，但是针对其作用机制目前少有研究，而麝香保心丸与缝隙连接重构关系目前尚不清楚。本实验拟通过腹主动脉缩窄大鼠模型观察麝香保心丸对压力超负荷所致心力衰竭时心肌重构及心室肌缝隙连接重构的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂及仪器 麝香保心丸由上海和黄药业提供；Cx43一抗、DAD显色试剂盒、免疫组化染色试剂盒均购于博士德公司；HE染色试剂盒购于北京碧云天生物技术公司；石蜡切片机、烤片机、自动脱水机均购于德国Leica公司；-80℃低温冰箱购于日本SANYO公司；冷冻离心机购于德国Eppendorf公司；心脏彩色B超机购于美国GE公司；垂直电泳仪器及转膜系统为中国北京六一仪器厂生产。

1.2 实验大鼠 成年雄性SD大鼠（Sprague-Dawley）30只，体质量200～250 g，南华大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（湘）2010-0006。

1.3 压力超负荷心力衰竭模型的制备 将实验大鼠随机分为假手术组 （SO组），心力衰竭模型组 （HF组）、心力衰竭模型+麝香保心丸组 （HS组），每组10只，均用10%的水合氯醛 （3 mL/kg）腹腔注射麻醉，固定，备皮，常规消毒后，沿腹正中线作一长约2 cm切口，分离组织，打开腹腔，HF组和HS组大鼠在肾动脉上方找到腹主动脉，然后用4号手术缝线将一个直径为0.7 mm的针头与腹主动脉一起结扎，随后取出该钢针，从而形成腹主动脉缩窄，验证腹主动脉通畅后，注入庆大霉素注射液预防感染，快速分层缝合关闭腹腔［4］。SO组大鼠除了不缩窄腹主动脉外其余步骤完全与上述相同。HS组通过灌胃的方法每天给予SBP 15 mg/kg（溶于双蒸水2 mL）灌胃2次，而SO组和HF组则用自来水灌胃［5］。常规喂养12周。

1.4 超声检测心动图 麝香保心丸干预12周后，麻醉大鼠，固定，剃胸前区毛，取仰卧位，由有经验的心脏超声医生用彩色多普勒超声诊断仪盲法测量，测量左室收缩期内径（Left ventricular systolic diameter，LVIDs），左室舒张期内径（Left ventricular diastolic diameter，LVIDd），射血分数（Ejection fraction，EF）。

1.5 HE心肌组织染色观察形态结构变化 处死大鼠后，纵向切取小块左心室心肌组织，置10%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，最后树胶封片。镜下观察：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。

1.6 Western blot测定麝香保心丸对心衰模型大鼠心肌Cx43和Cx45表达的影响 取小块左心室心肌组织剪成100 mg左右大小组织块，用于提取蛋白。以BCA蛋白定量试剂盒定量各组蛋白浓度。采用10%SDS-PAGE凝胶电泳，充分分离目的蛋白；将目的蛋白转移至PVDF膜上；将膜置于封闭液中于室温下摇床孵育2 h。封闭结束后，分别孵育兔抗大鼠Cx43和Cx45多克隆抗体 （1∶1 000），4℃过夜。TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶2 000），室温摇动孵育1 h。TBST缓冲液洗膜。将DAD显色试剂盒中的A和B两种试剂在避光的离心管中等体积混匀1 min，将此混合液均匀图于膜蛋白上，置于显影仪上曝光显影。

1.7 统计学分析 全部数据使用SPSS 18.0软件及EXCEL分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析，检验方差齐性，方差齐性的两两进行组间比较，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物情况 造模过程中，假手术组和心力衰竭组各死亡1只，可能死于麻醉意外和手术大出血。28只大鼠完成实验，其中SO组9只，HF组9只，HS组10只。

2.2 建模12周后各组大鼠的左室内径及EF值测量结果

与SO组相比，HF组和HS组大鼠心脏左室收缩期内径LVIDs，左室舒张期内径LVIDd明显增大，EF值下降均小于50%，与HF组相比，HS组大鼠心脏左室收缩期内径LVIDs和左室舒张期内径LVIDd减少，EF值增加，两组间差异具有统计学意义 （P＜0.05），结果见表1和图1。

表1 麝香保心丸对腹主动脉缩窄SD大鼠心脏B超参数的影响 （x±s）

2.3 HE染色观察麝香保心丸对心力衰竭大鼠心肌组织形态结构变化的影响 图2中HE染色显示SO组心肌纤维结构清晰，心肌细胞排列规则；HF组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞肥大，心肌细胞间隙增宽，间质可见纤维化；而用麝香保心丸干预的HS组，心肌细胞排列较规则，大部分心肌纤维呈平行排列，结构清晰，间质有少量疏松结缔组织。

2.4 麝香保心丸对心力衰竭大鼠心肌组织Cx43和Cx45表达的影响 Western blot结果显示：与SO组比较，HF组Cx43的表达显著减少 （P＜0.05）；与HF组比较，HS组Cx43的表达显著增加，SBP能够明显抑制心衰大鼠心肌Cx43表达的下调 （P＜0.05），见图3；与SO组比较，HF组Cx45的表达未明显变化 （P＞0.05）；而与HF组比较，HS组Cx45的表达也无明显改变 （P＞0.05），见图4。

图1 各组大鼠M型超声心动图结构参数变化

图2 心肌组织病理形态学改变

图3 SBP对心力衰竭大鼠心肌细胞Cx43表达的影响

图4 SBP对心力衰竭大鼠心肌细胞Cx45表达的影响

3 讨论

心力衰竭是大多数心血管疾病的终末期表现及主要死亡原因，正在成为本世纪最重要的心血管疾病，而心肌重构是心力衰竭发生发展的基本病理机制。心肌重构的病理主要表现包括心肌细胞肥大和凋亡，以及胞外基质纤维化。人们已发现心力衰竭时更容易并发心律失常和心源性猝死，而这与心肌重构时伴随的电生理重构有关。电生理重构包括离子通道重构和缝隙连接［6］。心力衰竭时发生的缝隙连接重构与心肌结构重构密切相关，故开发能同时逆转心肌结构重构及缝隙连接重构的药物，对治疗心力衰竭以及其合并的心律失常有着重要价值。

缝隙连接由缝隙连接蛋白组成，在心室肌细胞中主要有Cx43、Cx45、Cx40表达，其中Cx43是心室的主要缝隙连接蛋白。缝隙连接蛋白的表达异常，可导致细胞间电化学偶联的异常，从而可促使心律失常发生。Gutstein等［7］发现解剖Cx43基因剔除的纯合子鼠均因自发性室性心律失常而猝死。Hall等在扩张性心肌病幼鼠模型中发现在射血分数明显下降和明显左室重构之前就出现了Cx43表达的下调。提示Cx43的重构在心力衰竭的早期即可出现，同时在心力衰竭不同阶段可能存在表达差异［8］。本研究中发现腹主动脉缩窄构建的心力衰竭大鼠心脏左室组织中的Cx43表达明显的下调，但Cx45表达未发生明显变化。

麝香保心丸在临床中主要用于冠心病的治疗，但近些年来有研究发现麝香保心丸对心衰治疗有效。在老年退行性心瓣膜病并发左心衰竭患者中，给予常规治疗同时加服麝香保心丸，患者心功能较常规治疗组明显改善［9］；在心肌梗死后心力衰竭患者也得到类似结果［10］，但其中机制不明确。本实验发现，麝香保心丸可降低大鼠左室舒张期内径LVIDd，增加EF值，同时观察心肌超微结构发现与正常大鼠相比，心力衰竭大鼠心肌细胞排列紊乱，而麝香保心丸组心肌细胞排列紊乱明显改善，提示麝香保心丸麝香保心丸可以改善心功能，其机制可能与其逆转心力衰竭时的心肌重构有关。已有多个临床观察研究发现麝香保心丸对早搏、房颤、慢性心律失常都有一定的疗效，但麝香保心丸减少心律失常的机制少有研究，与缝隙连接重构的关系也未见报导。本实验发现心力衰竭大鼠心肌Cx43表达明显下调，而麝香保心丸可以上调心力衰竭大鼠心肌Cx43的表达，但对心肌Cx45表达没有明显影响。缝隙连接重构与心律失常的发生和心肌结构重构均有关，麝香保心丸可能具有通过抑制负性心肌重塑改善心力衰竭时心肌的缝隙连接重构从而减少心律失常的发生。该实验结果为探讨中药的抗心律失常的机制提供了新的思路。

［1］Itoh M，Takeishi Y，Nakada S，et al.Long-term treatmentwith angiotensin II type 1 receptor antagonist，CV-11974，restores beta-catenin mRNA expression in volume-overloaded rabbit hearts［J］.Heart Vessels，2002，17（1）：36-41.

［2］黄红漫，许其倓.麝香保心丸对慢性心力衰竭患者内皮功能及心功能的影响［J］.中成药，2004，26（Z1）：41-43.

［3］张力群，谢 娟，张惠群.麝香保心丸抗动物心肌缺血及心律失常的机理探讨［J］.中成药，2004，26（Z1）：27-29.

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1329-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.038

2014-08-18

国家自然科学基金项目 （81270181）；湖南省自然科学基金项目 （11JJ2046）

吴志雄 （1988—），男，硕士，从事心血管疾病研究。Tel：15211803302，E-mail：455247958@qq.com

*通信作者：杨 军（1972—），男，博士，副教授，副主任医师，从事心血管疾病研究。E-mail：yangjunincn@163.com