三种口腔溃疡中药制剂对小鼠成纤维细胞生长增殖和胶原合成的影响

金姗姗， 郑雅文， 张 洁， 齐 锐， 刘 斌， 李志革

（兰州大学口腔医学院，甘肃兰州730000）

三种口腔溃疡中药制剂对小鼠成纤维细胞生长增殖和胶原合成的影响

金姗姗， 郑雅文， 张 洁， 齐 锐， 刘 斌， 李志革*

（兰州大学口腔医学院，甘肃兰州730000）

目的探讨3种治疗复发性口腔溃疡中药制剂 （西瓜霜、云南白药、甘草泻心汤）在细胞水平上促进溃疡愈合的作用机制。方法建立小鼠口腔成纤维细胞体外培养模型，以华素片为对照，采用MTT、Elisa测定3种中药制剂对成纤维细胞增殖、胶原合成的影响。结果西瓜霜在促进成纤维细胞的增殖及胶原合成，抑制MMP-2，促进TIMP-1方面有较显著的作用。云南白药促进能够HYP的分泌和抑制MMP-2的分泌。甘草泻心汤对成纤维细胞有一定的抑制作用。结论提示临床上治疗复发性口腔溃疡时应联合用药或分期用药。

复发性口腔溃疡；西瓜霜；云南白药；甘草泻心汤；小鼠成纤维细胞L929；胶原合成；羟脯氨酸 （HYP）；金属基质蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）

复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer）是常见的口腔疾病之一，发病率高达20%左右，为口腔黏膜发病首位［1］。复发性口腔溃疡具有周期性、复发性和自限性等特征，溃疡烧灼痛明显，常给患者的生活和工作带来不便［2］。复发性口腔溃疡诱因复杂、机制不明，在临床治疗中以缓解疼痛、促进愈合为主，并无明确有效的治疗方法。市面上治疗复发性口腔溃疡的药物众多，但药物作用机制的研究比较欠缺，这造成医生和患者在选择药物时具有盲目性和偶然性。成纤维细胞的增殖和胶原合成是复发性口腔溃疡愈合的重要过程［3］。成纤维细胞分泌的金属基质蛋白酶 （MMP）及其抑制剂（TIMP），共同参与和调控胞外基质的降解和重建［4］。

中草药制剂现已成为治疗复发性口腔溃疡的常用药物，主要以市售西瓜霜、云南白药等为主［5］。目前本课题组在前期甘草泻心汤研究与应用的基础上，提出了甘草泻心汤治疗复发性口腔溃疡的观点，并取得了一定的临床效果，但是这类药物的治疗机理，尤其是在溃疡愈合方面的研究，目前未见相关报道。本实验建立了体外小鼠口腔成纤维细胞L929培养模型，以西药制剂华素片为对照，研究中药制剂西瓜霜、云南白药、甘草泻心汤对小鼠口腔成纤维细胞增殖及对羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）金属基质蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）金属基质蛋白酶抑制因子-1（metal matrix protease inhibitor-1，TIMP-1）合成的影响，在细胞水平上揭示其在溃疡愈合过程中的作用及机制，从而为临床用药提供一定的实验和选择依据。

1 材料

1.1 细胞株 小鼠口腔成纤维细胞系L929，购自中科院上海生化细胞所。

1.2 药品及试剂 西瓜霜 （主要成分为西瓜霜、锻硼砂、山豆根等），购自桂林三金药业股份有限公司产品，批号130214；云南白药 （主要成分为三七、重楼、麝香），购自云南白药集团股份有限公司产品，批号 ZDA1311；华素片 （主要成分碘），购自北京华素制药股份有限公司产品，批号1303142；甘草泻心汤（甘草12 g，黄芩9 g，半夏12 g，大枣12枚，黄连3 g，干姜9 g，党参9 g。购自惠仁堂药店），自制。DMEM培养基、新生小牛血清，购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶、四唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），购自美国Sigma公司；HYP、MMP-2、TIMP-1测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 试验药液制备 将甘草泻心汤草药粉碎成极细粉过筛并混合均匀，置于200 mL超纯水中，4℃24 h，12 000 r/min离心30 min，取上清液冷冻干燥，制得甘草泻心汤水提物。分别称取5 mg的西瓜霜、云南白药、华素片、甘草泻心汤溶于含10%胎牛血清和青、链霉素各100 IU/mL的10 mL DMEM培养基，用磁力搅拌器搅拌24 h后用氯气灭菌，再倍比稀释为125、62.5、31.25μg/mL的药液备用。0.00μg/mL为阴性对照组。

2.2 细胞培养［6］小鼠口腔成纤维细胞系L929用含10%胎牛血清和青、链霉素各100 IU/m L的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2饱和湿度的恒温孵育箱内培养2～3 d左右，当细胞密度达到70%～80%时传代。将培养瓶中培养液弃去，加0.25%胰酶消化2～3 min，倒置显微镜下观察，当大多数细胞由长梭形变圆时，立即向培养瓶中加培养液约5 mL，并轻轻吹打瓶壁使细胞脱落，按1∶4比例传代培养于75 mL培养瓶。

2.3 细胞接种［6］取对数生长期的 L929细胞，用0.25%胰酶充分消化成单细胞悬液。用含10%血清的DMEM培养液，调整细胞密度为2×104个/mL，接种到96孔板，每孔接种100μL，每孔设置6个重复孔。细胞贴壁24 h后，弃上清液，分别加入制备好的不同药液100μL，继续培养。阴性对照组为移去上清后，加入100μL含10%血清的DMEM培养基。

2.4 MTT检测［7］当细胞与药液作用24 h、48 h、72 h后，收集上清液，加入不含血清的DEME培养基100μL，再每孔加入MTT（5 g/L）20μL。常规继续孵育4 h，吸去培养液，每孔加入DMSO（二甲基亚砜）150μL，在振荡器上振荡10 min，待紫色结晶完全溶解后，立即用酶联免疫测定仪测定490 nm处的吸光度值 （OD值）。

2.5 HYP、MMP-2、TIMP-1测定 收集上清液，上清液中的HYP、MMP-2、TIMP-1水平分别采用小鼠HYP、MMP-2、TIMP-1 Elisa试剂盒进行测定。按试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线计算出上清液中HYP、MMP-2、TIMP-1的水平。每一个样品重复3次。

2.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，各项指标水平以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 3种中药制剂对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响 24 h时，西瓜霜 （图1-A）各质量浓度组OD值波动较大，可能由于药物的加入，成纤维细胞需要一定的适应时间；云南白药 （图1-B）各质量浓度组OD值与对照组差距无明显意义。甘草泻心汤 （图1-C）与西瓜霜组变化相似。华素片 （图1-D）各质量浓度组OD值与对照组差距无明显意义。48 h时，西瓜霜、华素片在31.25μg/mL下可以以时间-质量浓度依赖性地促进成纤维细胞生长；甘草泻心汤随质量浓度增加OD值降低，抑制作用明显。云南白药各质量浓度组OD值与对照组差距无明显意义。72 h时，西瓜霜、云南白药、甘草泻心汤、华素片在125μg/mL下培养72 h时对成纤维细胞有一定的抑制作用。见图1。

图1 不同药物组对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响Fig.1 Effect of different herbal preparations on the p roliferation of m ice fib roblasts L929

3.2 3种中药制剂48 h时对小鼠成纤维细胞HYP水平的影响 结果如图2所示，西瓜霜组、云南白药组在31.25μg/m L时小鼠成纤维细胞的HYP水平显著高于阴性对照组，随药物质量浓度增加，促进作用下降，无统计学意义。甘草泻心汤组随药物质量浓度增加，促进作用增强，在125μg/mL时达到顶峰。华素片组在31.25μg/m L、125μg/m L时小鼠成纤维细胞的HYP水平显著升高 （P＜0.05）。在该项指标检测中，西瓜霜、云南白药、华素片均在较低质量浓度就出现一定的促进作用。

3.3 3种中药制剂48 h时对小鼠成纤维细胞MMP-2水平的影响 结果如图3所示，4组药物在31.25μg/mL水平下对小鼠成纤维细胞的MMP-2水平有抑制作用，但无统计学意义；在62.25 μg/mL水平下对小鼠成纤维细胞的MMP-2水平具有显著性抑制作用；当质量浓度达到125μg/m L云南白药、甘草泻心汤、华素片组小鼠成纤维细胞的MMP-2值显著仍低于阴性对照组。在该项指标检测中，华素片随质量浓度的增加抑制作用加强。

图2 3种中药制剂48 h时对小鼠成纤维细胞HYP水平的影响Fig.2 Effects of three herbal preparations on hydroxyproline level in m ice fibrob last in 48 h

3.4 3种中药制剂48 h时对小鼠成纤维细胞TIMP-1水平的影响 结果图4所示，西瓜霜、甘草泻心汤对小鼠成纤维细胞的TIMP-1有明显促进作用；而在62.25μg/mL下云南白药和华素片具有抑制作用。

4 讨论

图3 3种中药制剂48 h时对小鼠成纤维细胞MMP-2水平的影响Fig.3 E ffects of three herbal preparations on MMP-2 level in m ice fibroblast in 48 h

图4 3种中药制剂48 h时对小鼠成纤维细胞TIMP-1水平的影响Fig.4 Effects of three herbal preparations on TIMP-1 level in m ice fibroblast in 48 h

复发性口腔溃疡是以疼痛和周期性复发为特点的口腔黏膜自限性溃疡性损害，是口腔黏膜最常见的疾病之一。复发性口腔溃疡诱因复杂、机制不清，目前临床上治疗的目的主要是缓解疼痛、促进愈合，而药物治疗机制的研究比较少见报道。传统中药制剂在临床上有广泛应用并取得了一定的治疗效果，但其作用机制的研究较匮乏。本试验建立小鼠口腔成纤维细胞体外培养模型，以西药制剂华素片为对照，从细胞水平研究西瓜霜、云南白药、甘草泻心汤对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，揭示中药制剂在溃疡愈合过程中的作用机制。

复发性口腔溃疡愈合的过程包括旧胶原的降解和新胶原的重排、沉积，参与此过程的主要细胞是成纤维细胞，其主要作用是参与形成肉芽组织、合成并分泌胞外基质、金属基质蛋白酶 （MMPs）及其抑制因子（TIMPs）［8］。在IL-1、IL-4、PDGF、FGF、及TNF等刺激下，由间充质细胞分化而来的成纤维细胞合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。同时成纤维细胞合成和分泌MMPs及其TIMPs共同参与和调控了细胞外基质的降解，MMPs和TIMPs的相互作用及平衡是胞外基质重建的关键［9］。本实验中西瓜霜和华素片可促进成纤维细胞的增殖，提示其促进溃疡愈合的作用可能与促进成纤维细胞的增殖有关，而云南白药对成纤维细胞的增殖无显著作用，甘草泻心汤对成纤维细胞的增殖具有抑制作用。

羟脯氨酸 （HYP）是胶原蛋白的主要组成成分，具有多种生理功能及独特的生物活性，常作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，同时具有加快伤口愈合的作用，可用于治疗各种皮肤疾病［10-11］。李秋营等通过对成纤维细胞中HYP水平的测定，较好地反映了成纤维细胞活性、增殖及胶原合成等情况［12］。与对照组相比，在4种药物作用下，上清液中的HYP水平明显上升，说明4种药物均可促进小鼠成纤维细胞分泌HYP，从而提示4种药物在溃疡愈合过程中可促进胶原的合成。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一组具有极大同源性的蛋白内肽酶的总称，与胞外基质降解和结缔组织修复紧密相关［13］。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是MMPs的特异性抑制因子，以1∶1的比例与MMPs结合，抑制其活性［14］。MMPs与TIMPs的平衡的破坏会影响到正常组织的重塑和创伤的愈合，其与许多疾病的发生相关［15］。MMP-2、9在正常的口腔黏膜组织中呈弱阳性表达，在慢性溃疡面中MMP-2、9表达与对照组有显著差异，呈阳性表达，同时在慢性溃疡面还存在TIMP-1的减少［16-17］。康媛媛的研究表明在病理条件下，MMP-2能降解黏膜组织中的Ⅳ胶原，表明其在人体黏膜组织的溶解破坏过程中有重要作用［18］。因此，可以推测口腔溃疡过程中胞外基质及基底膜的破坏与MMP-2的表达水平有关。在溃疡愈合初期，抑制成纤维细胞MMP-2的表达、促进TIMP-1的表达有利于溃疡的愈合。本实验结果显示，与对照组相比，4种药物都具有抑制成纤维细胞合成分泌MMP-2的作用，西瓜霜和甘草泻心汤可促进TIMP-1的合成分泌，但云南白药和华素片则对TIMP-1的合成分泌具有抑制作用。提示西瓜霜和甘草泻心汤在溃疡愈合的初期可抑制成纤维细胞MMP-2的表达和促进TIMP-1的表达，从而有利于溃疡愈合初期的胶原合成与沉积。

综上所述，西瓜霜在促进成纤维细胞的增殖及胶原合成，抑制MMP-2，促进TIMP-1方面有较显著的作用。云南白药对成纤维细胞的增殖无促进作用，但可促进HYP的分泌和抑制MMP-2的分泌，在溃疡愈合的早期发挥重要的作用。甘草泻心汤对成纤维细胞有一定的抑制作用，但可通过促进HYP、TIMP-1分泌，抑制MMP-2分泌，来促进溃疡的愈合。3种治疗复发性口腔溃疡的中药制剂对小鼠成纤维细胞增殖和胶原合成的作用机制不同，提示临床上治疗复发性口腔溃疡时应联合用药或分期用药，从而获得更好的临床治疗效果，但要明确药物对溃疡愈合的具体作用机制，还需进一步的实验探究。

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Effects of three herbal preparations for recurrent oral ulcer on proliferation and collagen synthesis of the fibroblasts in m ice

JIN Shan-shan， ZHENG Ya-wen， ZHANG Jie， QIRui， LIU Bin， LIZhi-ge*
（School of Stomatology，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

AIMTo study themechanisms of three kinds of herbal preparations（Watermelon Frost，Yunnan Baiyao，Gancao Xiexin Decoction）for recurrent oral ulcer on ulcer healing in cellular levels.METHODSMice fibroblast L929 was used as the in vitro model for recurrent oral ulcer；cydiodin was employed as the control drug. The effects of herbal preparations on the fibroblast proliferation and collagen production were determined by MTT assay and Elisa Kit，respectively.RESULTSWatermelon Frost promoted the fibroblast proliferation and collagen synthesis，inhibited MMP-2 level and increased TIMP-1 level；Yunnan Baiyao stimulated the secretion of HYP and down-regulated the secretion ofMMP-2 level；Gancao Xiexin Decoction inhibited the fibroblast.CONCLUSIONThe experimental data suggests that the clinical treatment for recurrent oral ulcer should be approached by combining these three preparations or applying them in different stages.

recurrent oral ulcer；Watermelon Frost；Yunnan Baiyao；Gancao Xiexin Decoction；mice fibroblast；collagen synthesis；hydroxyproline（HYP）；metalmatrix protease inhibitor-1（TIMP-1）

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1176-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.005

2014-07-15

“本科教学工程”国家级大学生创新创业训练计划 （201310730167）；甘肃省中医药科学技术研究课题 （GZK-2011-9）；甘肃省自然科学基金（1208RJYA011）

金姗姗（1992—），女，本科生。Tel：15214011979，E-mail：jinss1022@163.com

*通信作者：李志革 （1968—），男，教授，副主任医师，研究方向为口腔颌面外科学。Tel：13993141029，E-mail：lizhg@lzu.edu.cn