复方广金钱草提取工艺对大鼠利尿排石的影响

张 慧， 陈卓瀚， 陆海玲， 刘天竹，郭丽冰*， 黎行山， 陈艳芬

（1.广东药学院中药学院，广东广州510006；2.广州医科大学附属第五医院，广东广州510700）

复方广金钱草提取工艺对大鼠利尿排石的影响

张 慧1， 陈卓瀚1， 陆海玲1， 刘天竹1，郭丽冰1*， 黎行山2， 陈艳芬1

（1.广东药学院中药学院，广东广州510006；2.广州医科大学附属第五医院，广东广州510700）

目的观察复方广金钱草颗粒 （广金钱草、车前子、黄芪、党参、茯苓等组成）的水提取物、水提醇沉物和混合（部分水提，部分醇提）提取物的利尿排石作用。方法采用大鼠代谢笼法观察复方广金钱草不同工艺提取物的利尿作用，采用乙二醇和氯化铵诱导大鼠肾草酸钙结石模型，连续给药30 d后，观察大鼠成石率和检测各组大鼠尿草酸、尿钙含量和肾组织匀浆中草酸和钙的含量。结果复方广金钱草颗粒不同提取物均能促进大鼠排尿草酸和尿钙，但水提醇沉物和混合提物比水提物作用更好。结论复方广金钱草醇处理工艺对大鼠肾结石的形成产生抑制作用。

复方广金钱草颗粒；水负荷试验；排石实验；大鼠

复方广金钱草颗粒为12味中药组成的复方制 剂，具有利水排石，清热通淋等功效。该处方来源于广州医科大学第五附属医院的临床验方，主要用于小结石的治疗以及肾结石碎石后辅助排石，疗效显著。临床上原以汤剂的形式入药，但存在服用不方便、服用量大、携带不便、不易贮存等问题，故拟将其研制成颗粒剂。为将此方开发成六类中药新药，本实验观察复方广金钱草不同工艺提取物对大鼠的排石利尿药效，以便确定该复方的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 试验药物 复方广金钱草水提物 （8倍于药材量水提取3次，提取液浓缩至1.24 g/mL）、复方广金钱草水提醇沉物 （8倍于药材量水提取3次，结合醇沉工艺除去部分水溶性杂质，提取液浓缩至1.24 g/mL）、复方广金钱草混合提取物 （广金钱草、黄芪、党参、车前子、茯苓、牛膝8倍量水提［1-5］3次，结合醇沉工艺除去部分水溶性杂质，穿破石、冬葵子、路路通、甘草、瞿麦、泽泻采用60%乙醇提取［6-10］2次，第1次8倍量，第2次6倍量，将水提醇沉液与醇提液合并后浓缩至1.24 g/mL）为实验室自制。广金钱草、车前子、路路通等药材均购于广州致信中药饮片有限公司，由广东药学院李书渊教授鉴定，符合 《中国药典》2010年版一部规定。五淋化石丸 （广西梧州三鹤药业有限公司，批号121003），氢氯噻嗪 （山西云鹤制药有限公司，批号A130701）。

1.2 动物 Wister大鼠，雄性，体质量160～200 g，许可证号SCXK（粤）2011-0015，由南方医科大学动物实验中心提供。

1.3 试剂 乙二醇 （天津市富宇精细化工有限公司，批号2014214），氯化铵 （天津市大茂化学试剂，批号2013516），钙测试盒 （南京建成生物工程研究所，批号20140414），其他试剂均为分析纯。

1.4 仪器 680型酶标仪（美国Biorad公司），紫外可见分光光度计 （UV-2450），旋转蒸发器（IKA.HB10Basic）。

2 方法

2.1 大鼠水负荷实验 （代谢笼法）［11-12］选取160～200 g雄性大鼠50只，随机分为5组，每组10只，空白组、水提组 （18.6 g/kg）、水提醇沉组（18.6 g/kg）、混合提取组（18.6 g/kg）、氢氯噻嗪组，灌胃给药15 m L/kg，连续灌胃7 d。末次给药前12 h禁食不禁水。给药前1 h每组灌以生理盐水20 mL/kg。开始给药前轻轻下压大鼠下腹部使其排空余尿，给药后立即将大鼠放入代谢笼中，收集各组大鼠6 h的尿液，记录尿量。

2.2 大鼠排石试验 选取160～200 g雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只。空白组、水提组（18.6 g/kg）、水提醇沉组 （18.6 g/kg）、混合提取组（18.6 g/kg）、五淋化石丸组 （3 g/kg），灌胃给药15 mL/kg，每天灌胃1次，连续30 d。在此期间，除空白对照组外，其余5组每天给大鼠自由饮用1%乙二醇水溶液、每天灌以2%氯化铵1 mL/100 g，以形成肾结石。实验结束前一天将各组大鼠放入代谢笼，收集24 h尿液，记录尿量，并对尿液pH、尿草酸、尿钙进行检测。实验结束时颈椎脱臼处死动物，剖腹取出双肾，左肾进行病理学检查，右肾匀浆后测肾草酸以及肾钙含有量。

2.3 检测指标和方法

2.3.1 草酸根离子、钙离子［13-16］应用甲基麝香草酚蓝比色法测定尿钙及肾钙，应用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测定尿草酸及肾草酸含有量。

2.3.2 病理结果 大鼠脊椎脱臼法处死后称重，剖腹摘取双肾，纵向剖开左肾置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋。HE染色，于100倍光镜下观察有无明显草酸钙结晶沉淀物及游离结石或钙化斑作为肾结石的判断标准，根据结石形成的多少及肾脏损伤程度分为5级并进行量化评分［17］，0分：肾皮质、髓质及肾乳头均为无可见的结石和结晶沉淀物，肾脏外形无异常变化；1分：肾皮质或髓质可见少量散在结晶沉淀物；2分：肾皮质、髓质及肾盂可见结晶沉淀物或有小的游离结晶；3分：肾剖面可见较多结晶，并有游离结石形成，肾乳头可见钙化斑，肾盂扩张积水；4分：肾皮质、髓质可见大量结晶，有游离结石形成，肾乳头可见钙化斑，肾盂明显扩张积水。

2.4 统计学处理方法 计量资料数据均以均数±标准差 （x±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 外观特征 空白对照组大鼠反应灵敏，毛色有光泽，饮水适量，食欲旺盛，体质量由快变慢逐步增加，大便呈颗粒状，尿量正常，尿色淡黄。各组1%乙二醇饮水，2%氯化铵1 mL/100 g灌胃造模大鼠出现反应迟钝，精神萎靡，毛发无光泽，掉毛现象严重，饮水量大，食欲下降，活动少，尿量开始正常，后期尿量增加较大，大便稀溏。治疗组则出现尿量增加较少，精神饮食活动基本正常，其中混合提取组、水提醇沉组中大鼠的精神状态、活动情况、饮食及排尿量均优于水提组，与五淋化石丸组相当。

3.2 大鼠水负荷试验

表1 复方广金钱草不同工艺提取物对大鼠利尿作用的影响（x±s，n=10）Tab.1 Diurctic action of Compound Glechoma Graneles extractives processed by different methods in rats（x±s，n=10）

与对照组比较，水提醇沉组、混合提取组及氢氯噻嗪组均能显著增加大鼠尿量，提示复方广金钱草水提醇沉组和混合提取组具有一定的利尿作用。见表1。

3.3 大鼠排石实验

3.3.1 尿液生化指标检测结果及分析

由表2可知，与空白对照组相比，模型组大鼠尿量极显著升高 （P＜0.01）、尿草酸量极显著升高 （P＜0.01）、尿钙量极显著降低 （P＜0.01）。与模型组相比，五淋化石丸组尿草酸显著降低（P＜0.05），尿钙极显著增加 （P＜0.01）。药物组与模型组相比，水提醇沉组和混合提取组尿量显著降低 （P＜0.01），水提组、水提醇沉组、混合提取组尿草酸极显著性降低 （P＜0.01），水提组尿钙量极显著升高 （P＜0.01），混合提取组尿钙量显著升高 （P＜0.05）。各组之间pH值无显著性差异。

表2 高草酸诱致草酸钙结石模型中大鼠尿生化检验结果 （x±s，n=10）Tab.2 Urinary biochem istry results of rats in each group in experimen tal hyperoxaluria（x±s，n=10）

3.3.2 肾草酸、肾钙检测指标结果及分析

由表3可知，与空白对照组相比，模型组大鼠肾草酸浓度、肾钙浓度极显著升高 （P＜0.01）。与模型组相比，五淋化石丸组肾草酸浓度极显著降低（P＜0.01），肾钙浓度显著降低 （P＜0.05）。药物组与模型组相比，水提组、水提醇沉组和混合提取组草酸浓度极显著降低 （P＜0.01），水提组、混合提取组肾钙浓度极显著性降低 （P＜0.01）。

表3 高草酸诱致草酸钙结石模型中大鼠肾匀浆生化检验结果 （x±s）Tab.3 Biochem istry results in kidney homogenate of rats in each group in experimental hyperoxaluria（x±s）

3.3.3 肾脏病理切片评价 如图1所示，A、B、C、D、E、F 6组Wister雄性大鼠肾脏病理切片图，除A图 （正常对照组）外，B、C、D、E、F图中均可以观察到暗紫色透明为主草酸钙结晶存在，肾小管管腔扩大，其中B图 （乙二醇诱石，模型组）中大块草酸钙结晶聚集。C（乙二醇诱石+五淋化石丸干预组）、D、E、F图 （乙二醇诱石+复方广金钱草提取物干预组）存在草酸钙的数量、形状及大小与B图 （模型组）比较，均有不同程度降低。而在A图 （空白对照组）中没有观察到明显的草酸钙结晶。这表明了乙二醇诱致Wister雄性大鼠肾损伤的草酸钙结石模型成功。由于钙化斑是长期肾脏结石导致的病理现象，所以以上各组均为出现钙化斑。

由表4可知，模型对照组与空白组比较有极显著性差异，说明该试验造模条件合适；五淋化石丸组和各药物组与模型组相比均有极显著性差异。结果表明，不同工艺得到的复方广金钱草提取物均能明显防止乙二醇、氯化铵诱发的肾结石形成，并使大鼠结石形成率降低。水提组和混合提取组之间在肾结石程度方面存在显著性差异 （P＜0.05），其余各提取工艺之间无显著性差异。

图1 各组大鼠肾组织切片CaOx结晶显微镜检查 （HE染色，放大100倍）Fig.1 Crystalline formations in the rat kidney（HE staining.，m agnification×100）

表4 复方广金钱草不同工艺提取物对大鼠肾结石的影响（x±s）Tab.4 Lithagogue action for kidney stone of Compound G lechoma Granules extractives processed by differentmethods in rats（x±s）

4 讨论

1%乙二醇饮水，2%氯化铵1 mL/100 g灌胃，30 d，大鼠在饲养前期状况良好，随着造模时间延长，状况逐渐变差；肾剖面显示有少量散在草酸钙结晶，无炎性细胞，肾皮质和髓质无充血，肾小管略有扩张。而1%乙二醇饮水，0.5μg 1α-羟基维生素D3隔天灌胃14 d，大鼠造模过程中出现大鼠死亡，体重急剧下降，掉毛现象严重，饮水较多，吃饲料较少；肾剖面有大量游离结石；有炎性细胞，肾皮质和髓质充血，肾小管扩张明显。1α-羟基维生素D3会促进钙离子的吸收，加速草酸钙结晶的形成，从而容易形成结石，结石状况严重，严重损坏了大鼠的肾脏，大鼠的状况、存活时间短。结石的形成是缓慢的，中药治疗结石是个长期的过程，且药效较温和，复方广金钱草为临床经验方，主要用于肾结石碎石后辅助排石以及后期服用防止复发的作用，因此在前期预实验模型筛选时选择了造模成功率较大，造模强度较弱的造模条件 （1%乙二醇饮水，2%氯化铵1 mL/100 g灌胃［18］），而舍弃了造模强度过大的造模条件 （1%乙二醇饮水，0.5μg 1α-羟基维生素D3隔天灌胃［19］）。

综合试验尿液和肾的生化指标结果和肾脏的病理切片结果分析，得出该复方可能具有抑制体内草酸形成及促进钙离子排泄的作用，从而达到排石和防止结石复发的作用。在相当于人一天给药剂量的情况下，各组大鼠尿草酸均有不同程度减少，尿钙均有不同程度增加，其中水提组尿草酸的减少，尿钙的增加最明显，这可能与水提组大鼠的体重增长较少、给药期间的饮水量较少有关；水提醇沉组和混合提取组的药效较水提组好，可能是药物经过醇沉等处理后除去了部分杂质，减轻了大鼠的吸收负担，促进了有效成分的吸收，达到了增效的作用。

为将复方广金钱草由临床经验方开发成质量稳定、疗效好的六类新药复方广金钱草颗粒，本实验观察了复方广金钱草的不同提取工艺的排石利尿结果，实验结果表明，不同工艺得到的复方广金钱草提取物对肾结石的形成都具有良好的抑制作用，说明传统的复方广金钱草汤剂经过工艺学优化得到的提取物，既能达到服用体积小、医从性好、携带方便等效果，又保证其药效不降低。

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The impact of extraction technique for Com pound Glechoma Granules on removing kidney stone in rats

ZHANG Hui1， CHEN Zhuo-han1， LU Hai-ling1， LIU Tian-zhu1， GUO Li-bing1*， LIXing-shan2，CHEN Yan-Fen1
（1.College of Traditionnal Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006.China；2.The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China）

Compound Glechoma（CG）Granules；water load test；removal of kidney stone；rats

R284.2

：A

：1001-1528（2015）06-1186-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.007

2014-08-12

广东省科技厅社会发展科技项目 （20120318063），国家自然科学基金项目 （81073045，81302894）

张 慧（1990—），女，硕士生，研究方向为中药化学成分研究与开发。E-mail：zhanghuiapple@sina.com

*通信作者：郭丽冰 （1965—），女，教授，硕士生导师，主要从事中药化学成分研究与开发。