藏药绿萝花体外抑制肿瘤细胞生长的实验研究

杨 荣， 刘 群 ， 康莲莲， 王 赛， 韩金潭

(1. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041;2. 遵义职业技术学院，贵州遵义563000)

藏药绿萝花，别名石柑子(马蹄金、黄金葛)，产于西藏寒冷地带及喜马拉雅山脉区域，为天南星科喜林芋属植物绿萝花Scindapsus aureus (Linden ex Andre)Engl 的干燥花蕾［1］。据《藏医养身图说》记载，藏药绿萝花主治冠心病、糖尿病、高血压、血管炎、高血脂、脉管炎等［2］。目前有关藏药绿萝花的研究报道较少，仅限于其化学成分如挥发油、黄酮、还原糖的提取分离及其抗氧化、降血糖等药理作用研究［3-9］。探讨藏药绿萝花体外抑制肿瘤细胞生长作用，为其进一步开发利用提供科学依据。藏药绿萝花作为民族药同属中草药大范畴，本研究在中医药理论指导下，结合当地民间习以泡茶饮用及总化学成分产生整体效应的观点，以水煎干膏制剂为研究材料，选用5 种不同组织器官来源的人体癌细胞(肺腺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株SGC7901、恶性黑色素瘤细胞株MM-A375、神经母细胞瘤细胞株SHEP1)，以MTT 分析法测定绿萝花对各癌细胞的抑制率，筛选出具有显著抑制效果的SGC7901 细胞，绘制其生长曲线和细胞形态观察并以软琼脂克隆形成实验评估经绿萝花作用后的细胞增殖能力，以细胞凋亡检测探讨藏药绿萝花抑瘤机制，现将研究结果报告如下。

1 材料

1.1 研究材料 藏药绿萝花购于成都市荷花池中药材市场，由成都中医药大学中药学院中药实验室鉴定。室温密封干燥保存。

藏药绿萝花干膏的制备参考江平康等［10］的L9(34)正交试验设计方法，选用水萃取最佳工艺为浸泡0.5 h、20倍加水量、煎煮4 次、煎煮时间1 h，所得干膏率为24.5%，4 ℃冰箱保存备用。人体癌细胞(肺腺癌细胞株A549、肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株SGC7901、恶性黑色素瘤细胞株MM-A375、神经母细胞瘤细胞株SHEP1)均由西南大学药学院陈敏教授惠赠。

1.2 实验仪器 BD AriaⅡ流式细胞仪(美国BD Biosciences 公司)，Thermo Scientific Heraeus BB15 二氧化碳培养箱(美国Thermo 公司)，Olympus CKX41 倒置荧光显微镜(日本Olympus 公司)，AIRtech 超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，Eppendorf centrifuge 5810R 高速离心机(德国Eppendorf 公司)，BIO-RAD Model 680 酶标仪(美国Bio-Rad 公司)，培养器材(美国CORNING 公司)，DWHL388 超低温冰箱(中科美菱公司)，Milli-Q Synthesis 超纯水系统(美国Millipore 公司)等。

1.3 实验试剂及配制 胎牛血清(Hyclone 公司);DMEM培养液(Hyclone 公司);MTT (Sigma 公司);CCK-8 (碧云天公司);青霉素—链霉素双抗(Sigma 公司);二甲基亚砜(DMSO，Sigma 公司);胰蛋白酶(Trypsin);PBS 粉末(Amersco 公司);硫酸长春新碱对照品(阳性对照，阿拉丁试剂)等。磷酸缓冲液PBS，胰酶消化液，细胞冻存液，供试样品(用DMSO 溶解绿萝花水提干膏物，至初始质量浓度为20 mg/mL，冻存于-20 ℃备用。使用时用培养液稀释至目标质量浓度，并使DMSO 的含有量低于0.2%)，细胞培养液等。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素双抗的DMEM 培养液的细胞培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 MTT 实验方法 待测绿萝花干膏用DMEM 培养基稀释到质量浓度为50、100、200、300、400 μg/mL 并使DMSO 浓度小于0.1%，阳性对照为硫酸长春新碱;阴性对照为含0.1% DMSO 的DMEM 培养液。将处于对数生长期、状态良好的细胞用胰酶消化后，将细胞稀释为约5 ×104个/mL的密度接种于96 孔板上，每孔加入细胞悬液100 μL，置于37 ℃，5%CO2培养箱内培养。细胞贴壁后加药，每组4 个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱内培养48 h 后，避光条件下每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，继续温育培养4 h 后弃掉上清，每孔加入200 μL DMSO，置于摇床上慢速振摇5 min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量490 nm 处OD 值。

抑制率(%) = ［(阴性对照组OD 值- 加药组OD值)/阴性对照组OD 值］×100%

2.3 生长曲线测定 将处于对数生长期、状态良好的细胞用胰酶消化后，以2 000 个/孔的密度接种于96 孔培养板中，待细胞贴壁后，加入含目标质量浓度的绿萝花粗提物培养液，对照组为含同等浓度的DMSO 培养液，每组设3个复孔，分别培养1、2、3、4、5、6、7 d。每天定时取出培养板，每孔加入20 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养2 h，酶标仪上450 nm 处测定各孔吸光度值，以吸光度值表示细胞增殖能力大小，各组取3 孔平均值，绘制生长曲线。

2.4 细胞形态观察 取对数生长期的SGC7901 细胞接种于6 孔培养板中，贴壁后，吸出旧的培养液，加入含目标质量浓度的绿萝花新鲜培养液;用含同等浓度的DMSO 而不含药物的新鲜培养液做阴性对照组，培养24 h 后，置于倒置显微镜上，随机选择视野进行拍照观察。

2.5 软琼脂克隆形成实验 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM 培养液调整细胞密度至1 000 ～2 000 个/mL;用蒸馏水分别配制1.2%和0.6%两个浓度软琼脂，高压灭菌后，维持在40 ℃中不会凝固。底层琼脂的制备:按1 ∶1 比例使1.2%的琼脂糖和2 ×DMEM 培养基(含有2%抗生素和20%的胎牛血清)混合，使用6 孔板，每孔1.5 mL (取5 mL 的1.2%琼脂糖和5 mL的2 ×DMEM 培养基混匀)，室温放置30 min 冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。上层琼脂的制备:按1 ∶1比例0.6%的琼脂糖和2 ×DMEM 培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入细胞悬液，平均每个孔接种1 000 ～2 000个细胞。此时，设置给药组和对照组，给药组为500 μg/mL绿萝花粗提物，对照组为含同等浓度的DMSO培养液，每组3 个重复。使用6 孔板，每孔1 mL (取3.5 mL 的0.6%琼脂糖和3.5 mL 的2 ×1 640 培养基充分混匀)，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37 ℃、5%CO2温箱中培养2 ～3周;待克隆形成后，把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆大小，并采集图像。

2.6 细胞凋亡检测 将处于对数生长期、状态良好的细胞用胰酶消化后，接种于6 孔板中，细胞贴壁后，加入含500 μg/mL 绿萝花粗提物的培养液，对照组为含同等浓度的DMSO 培养液，每组3 个重复;培养24 h 后，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS 洗涤贴壁细胞后，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液(需避免胰酶的过度消化);加入细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1 000 ×g 离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数(加入细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶;残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC 导致染色失败);取5 ～10 万重悬的细胞，1 000 ×g 离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞;加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀;室温(20 ～25℃)避光孵育10 min (可以使用铝箔进行避光);1 000 ×g离心5 min，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞;加入10 μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置10 min;随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光。

3 结果与分析

3.1 绿萝花提取物对5 种肿瘤细胞株生长的抑制作用MTT 法测定绿萝花提取物在质量浓度为50、100、200、300、400 μg/mL 时，作用48 h 后分别对A549、HepG2、SGC7901、SHEP1、MM-A375 5 种肿瘤细胞生长的抑制作用。结果显示，不同质量浓度的绿萝花提取物处理5 种细胞48 h 后，随着药物剂量的增加，其细胞生长增殖抑制呈剂量依赖关系，见表1。结合图1，5 种肿瘤细胞的存活率逐渐降低，其中绿萝花提取物对肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞SGC7901 有较为显著的体外增殖抑制作用，其IC50值分别为550.04 μg/mL 和467.39 μg/mL。

表1 绿萝花提取物对5 种肿瘤细胞株的生长抑制率

图1 绿萝花提取物对5 种肿瘤细胞株的细胞生长抑制柱状图

3.2 绿萝花提取物对胃癌细胞SGC7901 生长的影响 绿萝花提取物对SGC7901 细胞显示出较为显著的细胞毒活性。实验中选用SGC7901 细胞作为绿萝花体外抑制肿瘤细胞生长研究的模型，开展进一步实验。图2 显示，经不同质量浓度的绿萝花提取物作用后，SGC7901 细胞的存活率逐渐下降，并呈现剂量依赖关系。与DMSO 处理的对照组相比，在质量浓度为50 μg/mL 时，有94.5%的细胞存活，质量浓度为100 μg/mL 时，存活细胞下降至86.2%。随着作用质量浓度的升高，当质量浓度达到200、300 和400 μg/mL时，细胞的存活率分别为73.6%、66.9% 和59.4%，并且均具有显著性差异。使用origin 7.5 软件计算获得绿萝花提取物对SGC7901 细胞毒活性的IC50值为467.39 μg/mL。考虑其IC50值，实验中选用500 μg/mL 作为其最佳作用质量浓度进行下一步研究。图3 显示，500 μg/mL的绿萝花提取物对SGC7901 细胞生长曲线的影响，在96 孔板中铺种2 000 个细胞，并于贴壁后，加入提取物处理，对照组加入等浓度的DMSO。在接下来的7 d中，于同一时间加入CCK8 试剂孵育2 h 后，使用酶标仪测定其OD 值，获得细胞每天的生长趋势。在对照组中，随着时间的延长，测得的OD 值呈增长趋势，表示其孔中细胞数目在不断增多，细胞在不断生长。在500 μg/mL 的绿萝花提取物处理的实验组中，细胞的生长受到了明显的抑制，其测定的OD 值呈降低趋势，并且具有时间依赖性，作用时间越长，生长的细胞数目越少。实验结果表明，绿萝花提取物在体外具有显著抑制胃癌细胞SGC7901 生长的作用。

图2 绿萝花提取物对人胃癌细胞SGC7901 存活率

3.3 绿萝花提取物对胃癌细胞SGC7901 形态结构的影响图4 表明，500 μg/mL 的绿萝花提取物与SGC7901 细胞共培养24 h 后其形态变化表现出绝大部分细胞皱缩，细胞形态变圆，细胞周围变亮(细胞周围变亮是一种细胞贴壁变松的表现)。对照组细胞形态正常，呈椭圆形且细胞周围未出现异亮区域。

图3 绿萝花提取物对人胃癌细胞SGC7901 生长曲线折线图

图4 绿萝花提取物对人胃癌细胞SGC7901 形态的影响

3.4 绿萝花提取物对胃癌细胞SGC7901 克隆形成的影响软琼脂克隆形成实验(soft agar assay)是肿瘤研究领域中一种重要的体外实验，曾被称为人类肿瘤干细胞实验(human tumor stem cell assay)，被用来筛选转化细胞、研究干细胞和祖细胞的生物学特性及筛选抗肿瘤药物。在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落或克隆。肿瘤细胞能无限繁殖，所以肿瘤细胞具有这种能力，而分化成熟的细胞则不能形成集落。将处理后的肿瘤细胞(单细胞悬液)存放在软琼脂培养基中进行培养，这样每个有肿瘤特性的细胞就能形成一个集落，通过计算集落的数量了解肿瘤细胞的生长状况及生存增殖能力。图5显示，经绿萝花提取物作用后，细胞克隆数目明显减少，克隆形成体积明显变小，与对照组具有显著性差异。说明在细胞非贴壁生长状态下，绿萝花提取物对人胃癌细胞SGC7901 的生长增殖情况表现出显著地抑制作用。

3.5 绿萝花提取物对胃癌细胞SGC7901 细胞凋亡的影响细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病等。因此，在绿萝花提取物抑制细胞增殖的基础上，是否也能诱导SGC7901 细胞凋亡的发生进行了研究。图6 显示，在经500 μg/mL 的绿萝花提取物作用后，引起了38.41%的细胞凋亡，与对照组引起的13.19%细胞凋亡数具有显著性差异。实验结果表明，绿萝花提取物诱导了人胃癌细胞SGC7901 凋亡的发生。

图5 Soft agar 检测绿萝花提取物对SGC7901 细胞克隆形成的影响

图6 流式细胞仪检测绿萝花提取物对SGC7901 细胞凋亡的影响

4 讨论与结论

4.1 抗肿瘤细胞研究方法［11-13］MTT 分析法以还原3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)为基础。MTT 是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶的作用下可将黄色的MTT 还原为不溶性的蓝紫色的甲臢(formazane)，死细胞琥珀酸脱氢酶消失，MTT 不被还原。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm 或570 nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，结晶形成的量与细胞数成正比。CCK-8 的原理跟MTT 是相同的，不同之处在于CCK-8 法生成的formazane 是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差，其重复性优于MTT，且对细胞毒性小。考虑到测定生长曲线时，需要每天都进行吸光度的测定，为了保证操作的便捷性与实验的可靠性，因此在测定生长曲线时选用CCK-8 试剂。软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力的两个重要性质。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。Annexin-V 是一种分子质量为35.8 kDa 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶 (propidine iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

4.2 绿萝花对体外肿瘤细胞生长试验 已有研究报道，绿萝花及其提取部分具有对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及治疗糖尿病的功效，如石油醚提取物、乙酸乙酯提取物具有很强的α-葡萄糖苷酶的抑制作用，可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂及制备治疗糖尿病药物［1］。但至今没有任何关于绿萝花在抗肿瘤研究方面的报道。因此，本研究开展了对绿萝花提取物体外抑制肿瘤细胞生长作用的研究。首先选用了不同组织来源的5 种肿瘤细胞(人肺腺癌细胞株A549，人肝癌细胞株HepG2，人胃癌细胞株SGC7901，人恶性黑色素瘤细胞株MM-A375，人神经母细胞瘤细胞株SHEP1)使用MTT 法对其细胞毒性进行测试，发现不同质量浓度的绿萝花提取物处理5 种细胞48 h 后，随着药物剂量的增加，其细胞生长增殖抑制呈剂量依赖关系，5 种肿瘤细胞的存活率逐渐降低，其中绿萝花提取物对人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞SGC7901 有较为显著的体外增殖抑制作用，其IC50值分别为550.04 μg/mL 和467.39 μg/mL。其次考虑其IC50值，研究中选用500 μg/mL 绿萝花作为其最佳作用质量浓度，以SGC7901 细胞作为体外抑制肿瘤细胞生长研究的模型，采用CCK8 法对细胞生长曲线进行测定，结果发现500 μg/mL 的绿萝花提取物处理的实验组中，细胞的生长受到了明显的抑制，其测定的OD 值呈降低趋势，并且具有时间依赖性，作用时间越长，生长的细胞数目越少，表明绿萝花提取物在体外能够以时间依赖方式抑制SGC7901 细胞的生长，同时对其细胞形态也有较大影响。研究结果证实绿萝花提取物在体外具有显著抑制人胃癌细胞SGC7901 生长的作用。再者通过软琼脂克隆形成实验，经绿萝花提取物作用后，人胃癌细胞SGC7901 克隆数目明显减少，克隆形成体积明显变小，与对照组具有显著性差异。经细胞凋亡检测，绿萝花提取物作用后，引起了38.41%的人胃癌细胞SGC7901 细胞凋亡，与对照组引起的13.19%细胞凋亡数具有显著性差异。研究结果表明:在细胞非贴壁生长状态下，绿萝花提取物对人胃癌细胞SGC7901 的生长增殖情况表现出显著地抑制作用并诱导人胃癌细胞SGC7901 凋亡的发生。

4.3 结论 肿瘤细胞生长的抑制可能是多方面的原因，包括细胞增殖的抑制、细胞周期阻滞、细胞凋亡的诱导等［14-15］。肿瘤细胞是永生性细胞，如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力，是首先考虑的问题。大多数抗癌药物都能引起其敏感细胞的凋亡，如DNA 复制抑制剂、抗代谢剂、拓朴异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂以及酪氨酸蛋白酶抑制剂等。本研究选用细胞增殖和细胞凋亡作为研究内容，使用soft agar 法作为对细胞增殖研究的手段，结果显示，绿萝花提取物能很好地在SGC7901 细胞非贴壁生长状态下，抑制其生长增殖作用;SGC7901 细胞克隆数量显著下降，克隆大小明显变小并能引起38.41%的SGC7901 细胞凋亡。综上所述，绿萝花提取物在体外能通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长。

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