板蓝根糖肽的组成测定

胡 坪， 陈 烨， 杨子峰， 高云霄， 张 敏， 章弘扬， 王月荣*

(1. 上海市功能性材料化学重点实验室，华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237;2. 澳门科技大学中医药学院，中国澳门;3. 广州医学院第一附属医院，呼吸疾病国家重点实验室，广东 广州510230;4. 华东理工大学药学院，上海200237)

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根，始载于《神农本草经》，有清热解毒、凉血利咽功能。临床上常用于病毒性疾病及细菌性感染疾病，但其抗病毒物质基础及作用机制尚不十分明确［1］。板蓝根常以水溶性部分入药，多糖是水溶性部分的主要成分，占板蓝根药材生药量的9.38% ～22.09%［2］，被认为是板蓝根抗病毒的物质基础之一［3］。亦有文献报道，板蓝根抗病毒的活性成分可能为糖肽与蛋白或多肽的复合物［4］，即糖蛋白或糖肽。目前，针对板蓝根多糖结构的研究较多，而关于其糖蛋白或糖肽的相关研究则鲜有报道。

本实验从板蓝根中分离得到均一糖肽，重点研究该糖肽的氨基酸组成和单糖组成。以响应面曲线法优化糖肽中氨基酸水解条件，柱前在线衍生高效液相色谱法［5-6］测定氨基酸组成，并利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化法测定其单糖组成，为阐明板蓝根糖肽的一级结构及其抗病毒机制奠定基础。

1 仪器与试剂

Agilent 1100 高效液相色谱仪(Agilent 公司，美国)配备DAD 检测器和Alltech 3300 ELSD 检测器(上海埃纹斯科贸有限公司);RE-52C 旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器有限公司);UV-2550紫外可见分光光度计(SHIMADZU Corporation，Japan);FD1 冷冻干燥机(北京博医康仪器有限公司);CH-8606 微量分析天平(瑞士梅特勒托利多公司);D100 B 蠕动泵(上海青浦沪西仪器厂);BSZ-100 自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂);40 Hz 300 W 数控功率可调加热超声波清洗机(上海声彦超声波仪器有限公司);EPED-E2-10TF 超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司);TSK G3000PW 凝胶色谱柱 (日本TOSOH 公司);Eclipse XDB-C18柱 (美国Agilent 公司);Inertsil ODS-SP 柱(日本Shimadzu-GL 公司)。

板蓝根(产自广州白云山和记黄埔中药有限公司GAP 基地，安徽阜阳);硫酸(分析纯，江苏永华精细化学品有限公司);石油醚(沸程60 ～90 ℃)，苯酚(分析纯，上海试剂一厂);DEAE-琼脂糖 (GE Healthcare);Sephacryl-200 (GE，Sweden)，乙腈(色谱纯，Honeywell);无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);三氟乙酸(CP，上海凌峰化学有限公司);硼砂(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司);3-巯基丙酸(萨恩化学技术有限公司，纯度98%);葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、D-果糖(上海源聚生物科技有限公司，纯度99%);D-葡萄糖醛酸(Johnson 公司，纯度98%);标准葡聚糖T-1(Mw=1 000)、T-2 (Mw=5 000)、T-3 (Mw =12 000)、T-4 (Mw =50 000)(瑞士Fluka 公司);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮PMP (阿拉丁试剂，99%);17 种氨基酸混合标准溶液包(含15 种一级氨基酸和2 种二级氨基酸，Sigma 公司);邻苯二甲醛OPA (Sigma 公司，色谱纯，纯度≥99%)、9-芴甲基氯甲酸酯FMOC (Sigma 公司，色谱纯，纯度≥99%)。

2 方法与结果

2.1 板蓝根糖肽的提取和分离纯化 板蓝根糖肽的提取、分离、纯化步骤参考文献［7-8］。取板蓝根药材粉末约500 g，用4 倍石油醚进行回流脱脂1 h，药渣室温挥干后，用10 倍量去离子水回流提取2 h，冷却，离心，倾出上清液。药渣再用10 倍量去离子水回流提取2 h，冷却后，离心。合并两次提取的上清液，减压浓缩至药液比1 ∶3 ～1 ∶4。加入一定量的无水乙醇，使提取液含醇量达50%，静置过夜，离心，弃去沉淀。上清液继续加入无水乙醇至含醇量达70%，静置过夜，离心。沉淀冷冻干燥，得板蓝根粗多糖。取适量板蓝根粗多糖，溶解，加入等体积的10% 三氯乙酸溶液，振摇、离心除去沉淀，如此往复，直至再无沉淀析出，即得脱蛋白板蓝根粗提物。

取适量板蓝根粗提物用去离子水溶解，依次用DEAE-fast flow 柱、Sephacryl-200 柱层析分离，水洗脱，苯酚-硫酸法［9］和紫外分光光度法同时检测，合并峰位，冷冻干燥，得到一精制板蓝根糖肽ISP。

2.2 板蓝根糖肽纯度及分子质量测定 采用GPCELSD 法测定板蓝根糖肽ISP 的纯度及分子质量分布［10］。色谱条件为TSKG3000 凝胶色谱柱;流动相为5 mmol/L 甲酸铵水溶液，体积流量为0.8 mL/min，进样10 μL;ELSD 检测器漂移管温度85 ℃，气体流量1.6 L/min。

取不同分子质量的葡聚糖对照品(Mw 分别为1 000，5 000，12 000，25 000，50 000，150 000)配制成质量浓度约为10 mg/mL 的标准溶液，在上述色谱条件下进行测定，由标准多糖的分子质量对数与保留时间求得回归方程为lg(Mw)=9.012 7 -0.532 4t，相关系数r=0.998。

取10 mg 板蓝根糖肽样品溶于1 mL 纯水中，按上述色谱条件进行测定，发现板蓝根糖肽经凝胶色谱分离后得到一个单一对称色谱峰，表明该样品是均一的［11］;该色谱峰在210 nm、280 nm 处均有紫外吸收，且ISP 苯酚硫酸法显色明显，推测板蓝根糖肽是与肽链结合的均一糖肽。根据板蓝根糖肽在凝胶色谱中的保留时间，由标准曲线计算出其重均分子质量(Mw)约为21 000。

2.3 板蓝根糖肽的单糖组成分析［12］

2.3.1 糖肽中糖链的水解 称取板蓝根糖肽3.91 mg 于5 mL 安瓿瓶中，加入3 mL 2 mol/L 的三氟乙酸(TFA)，封管，110 ℃烘箱中加热水解2 h，冷却至室温，溶液于40 ℃减压浓缩至干，加甲醇1.5 mL 减压蒸干，如此重复操作4 ～5 次，以除尽TFA，并浓缩至干。

2.3.2 PMP 柱前衍生化分析 取1 mL 的单糖混合对照品溶液(葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖质量浓度均为0.400 mg/mL)，加入1 mL 的0.6 mol/L NaOH 溶液，置于10 mL 的具塞试管中混合均匀;加入1 mL的0.5 mol/L PMP 甲醇溶液，混匀后，置于70 ℃烘箱中加热反应30 min，取出，室温放置10 min;再加入1 mL 盐酸溶液(0.3 mol/L)中和。加3 mL 三氯甲烷，振摇，静置，弃去三氯甲烷相，萃取3 次。水相用0.45 μm 微孔膜过滤后供HPLC 进样分析。

将已用TFA 酸水解处理的ISP 样品，用1.3 mL 超纯水溶解，取1 mL 于10 mL 试管中，按标样的方法进行衍生化和测定。

HPLC 色谱条件为:ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L 磷酸二氢钠和0.1 mol/L 磷酸氢二钠体积比43.5 ∶ 56.5，pH6.7)-乙腈(体积比为85 ∶15);柱温30 ℃;检测波长250 nm;体积流量1.0 mL/min;进样体积20 μL。

2.3.3 板蓝根糖肽的单糖组成分析结果 板蓝根糖肽水解产物PMP 衍生色谱图如图1 (B)所示，通过与标准单糖混合物的PMP 衍生色谱图(图1A)对照，可确定板蓝根糖肽中含有葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖。通过单点校正法可得板蓝根糖肽的单糖组成为甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶ 阿拉伯糖= 132.6 ∶ 5.0 ∶ 1.0 ∶7.6 ∶7.0∶23.8 ∶76.8，糖肽中糖的总质量百分数约为94.5%。

图1 标准单糖混合物 (A)和板蓝根糖肽水解产物(B)的PMP 衍生色谱图Fig.1 PMP derivative HPLC chromatograms of standard mixture of monosaccharide (A)and hydrolysis product of glycopeptide of Radix Isatidis (B)

2.4 板蓝根糖肽的氨基酸组成分析

2.4.1 糖肽中肽链酸水解条件的响应面试验设计

影响糖肽中肽链水解程度的因素有很多，为了全面考察各个因素的影响以及因素之间的相互影响，本实验选取响应面分析(RSA)法对肽链的水解条件进行优化。

在进行响应面分析之前，应先通过单因素试验来选取因素和水平。影响糖肽水解的主要因素有酸浓度、水解时间、水解温度等。本试验以盐酸作为水解酸，浓度选取1、3、6、9 mol/L 四个水平;水解时间选取12、24、60、72、84 h 五个水平;水解温度选取100、110、120、150 ℃四个水平，以糖肽水解液(5.57 mg/mL)中苏氨酸的峰面积为评价指标，分别进行单因素试验。在单因素试验结果的基础上，依据Box-Benhnken 中心组合设计，选取酸浓度、水解时间、水解温度为因素，每个因素取3 个水平。以(-1，0，1)编码，各编码值如表1 所示。

表1 响应面试验因素水平Tab.1 Factors level table of response surface analysis

2.4.2 响应面试验设计结果 根据表1 设计了三因素三水平共17 个试验点的响应面分析试验。实验方案与结果见表2。其中12 个为析因试验，5 个为中心试验。

应用Design-Expert 8.0.5 软件对表2 中的数据进行二次多元回归拟合，得到水解时间、酸浓度、水解温度与苏氨酸峰面积之间的二次多项回归方程。A=1 263.478 19 +29.277 73X1-0.472 69X2+8.234 33X3- 0.845 31X1X2- 0.053 813X1X3-0.340 75X2X3-0.442 43X+7.104 23X-0.018 798X

表2 响应面试验方案及结果Tab.2 Scheme and results of response surface analysis

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。

表3 响应面试验方差分析结果Tab.3 Variance analysis results of the response surface analysis

表3 表明，一次项中酸浓度及水解时间对苏氨酸峰面积的线性效应显著;二次项中酸浓度对苏氨酸的曲面效应极显著，水解时间对苏氨酸的曲面效应显著;各因子间交互作用不显著。在本实验设计范围内回归方程显著性检测P ＜0.000 1，模型的确定系数为0.976 6，说明该模型能解释97.66%的响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，试验误差较小，证明应用响应面优化的糖肽的肽链水解条件是可行的。

图2 ～图4 是苏氨酸峰面积的三维响应面曲线和等高图。可以看出，当水解温度和水解时间都固定时，苏氨酸峰面积随酸浓度的变化幅度最大，而随水解温度和水解时间的变化幅度相对较小。所以，酸浓度对苏氨酸峰面积的影响较为显著。通过最优化分析，最佳水解条件为水解时间为17 h，水解温度为104 ℃，酸浓度应尽可能的大，但考虑到操作的可行性，酸浓度取10 mol/L。

图2 水解时间固定在0 水平，Y = (A，B)响应面和等高图Fig.2 Hydrolysis time fixed at level 0，Y= (A，B)of the response surface and contour map

图3 水解时间固定在0 水平，Y = (A，C)响应面和等高图Fig.3 Hydrolysis time fixed at level 0 ，Y = (A，C)of the response surface and contour map

图4 水解时间固定在0 水平，Y= (B，C)响应面和等高图Fig.4 Hydrolysis time fixed at level 0，Y = (B，C)of the response surface and contour map

2.4.3 氨基酸的在线柱前衍生化分析方法 色谱条件为:Inertsil ODS-SP 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相A 为40 mmol/L Na2HPO4，用NaOH溶液调pH 至7.8，流动相B 为ACN-MeOH-水(45 ∶45 ∶10)，梯度洗脱(0.0 ～1.9 min，2.0%B;1.9 ～18.1 min，1.9% ～57% B;18.1 ～18.6 min，57% ～100.0% B;18.6 ～22.30 min，100%B);体积流量1.0 mL/min;柱温40 ℃;检测器UV 338 nm、262 nm。

邻苯二甲醛(OPA)溶液的配制:10 mg OPA溶于1 mL 溶液(0.16 mL 甲醇+0.14 mL 硼酸缓冲液+0.69 mL 纯水+0.01 mL 3-巯基丙酸)。硼酸缓冲液的配制:0.1 mol/L，用0.4 mol/L 的氢氧化钠调节pH 至10。9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)溶液的配制:10 mg FMOC 溶于1 mL 乙腈。

氨基酸的柱前在线衍生化在高效液相色谱仪自动进样器的定量环中进行。自动衍生程序为［13］:抽取硼酸盐缓冲液2.5 μL;抽取样品1.0 μL;混合5 次;等待0.20 min;抽取OPA 溶液1.0 μL;混合10 次;抽取FMOC 溶液1.0 μL，抽取纯水32 μL，等待0.3 min 进样。

2.4.4 板蓝根糖肽的氨基酸组成分析 吸取17 种氨基酸的混合标准溶液(浓度均为2.5 μmol/mL)1 μL，按“2.4.3”项下柱前在线衍生化程序衍生并进行HPLC 测定。

将ISP 配制成5.57 mg/mL 的水溶液，按照响应面曲线的优化条件对其进行水解，取1 mL 水解液，氮吹至干，用100 μL 纯水复溶，按“2.4.3”项的柱前在线衍生化程序衍生并进行HPLC 测定。以单点校正法计算板蓝根糖肽ISP 的氨基酸组成。

2.4.5 板蓝根糖肽氨基酸组成分析结果 本实验采用的氨基酸分析法将自动在线衍生化与HPLC 相结合，其中一级氨基酸用OPA 进行衍生，二级氨基酸用FMOC 进行衍生。结果发现，板蓝根糖肽水解液中未检测到二级氨基酸。将板蓝根糖肽水解液OPA 衍生色谱图(图5B)与15 种一级氨基酸的OPA 衍生色谱图(图5A)比较，确定其氨基酸组成主要为苏氨酸等12 种一级氨基酸。

将板蓝根糖肽ISP 按最优的水解条件进行水解后进行在线柱前衍生化HPLC 分析，以单点校正分别计算出每种氨基酸的含有量，结果列于表4 中。经换算，板蓝根糖肽ISP 中的肽链组成为(各氨基酸摩尔比)天门冬氨酸∶谷氨酸∶丝氨酸∶组氨酸∶苏氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶缬氨酸∶苯丙氨酸∶异亮氨酸∶亮氨酸∶赖氨酸=3.8 ∶3.8 ∶2.5 ∶0.7 ∶2.5 ∶1.1 ∶2.9 ∶1.9 ∶0.6 ∶1.0 ∶1.5 ∶1.3，总氨基酸质量百分数约为5.4%。

图5 15 种一级氨基酸标样(A)和精制板蓝根糖肽水解产物(B)的OPA 衍生化产物色谱图Fig.5 OPA derivatives products chromatograms of 15 kinds of amino acids standard solution (A)and ISP hydrolysis product (B)

表4 精制板蓝根糖肽水解产物中12 种氨基酸的量(n=3)Tab.4 Contents of 12 kinds of amino acids in ISP hydrolysis product (n=3)

3 讨论

3.1 本实验采用水提醇沉法从板蓝根药材中提取板蓝根粗多糖。经预实验发现，50%乙醇醇沉得到的粗多糖中大多是淀粉质，溶解性极差，因此被弃去。70%乙醇醇沉得到的粗多糖分子质量在几千到几万之间，而再用90%的乙醇醇沉得到的糖分子质量大多小于1000。因此，本实验选取了具有较大研究价值的70%醇沉粗多糖进行进一步的分离纯化。

3.2 PMP 柱前衍生化法反应条件温和，灵敏度高，且产物无异构体，常用于测定多糖的单糖组成。然而，该方法并不能衍生化酮糖，因此，在进行板蓝根糖肽的单糖组成测定之前，还利用HPLCELSD 方法测定了板蓝根糖肽水解液，结果表明，板蓝根糖肽水解液中未见果糖色谱峰。由于HPLCELSD 法对单糖混合物的分离能力不及PMP 法，故本实验选取PMP 衍生化HPLC 法测定板蓝根糖肽的单糖组成。

3.3 糖肽的氨基酸组成分析包括糖肽中肽链的水解及氨基酸残基的定性定量分析两个步骤。响应面分析法(RSA)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，其中，Box-Behnken 的中心组设计是常见的RSA 法，适用多个因素的优化试验［14］。本研究采用RSA 优化糖肽的水解条件，模型与实际实验拟合良好，表明该方法适合用于糖肽水解条件的优化。

3.4 本实验分离得到一种板蓝根均一糖肽。经PMP 柱前衍生化HPLC 法测定，其糖链主要由甘露糖、阿拉伯糖等7 种单糖残基组成，其质量百分数约为94.5%，表明该糖肽的糖成分较多。经OPA柱前在线衍生化HPLC 法测定，板蓝根糖肽的肽链主要由苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等12 种氨基酸残基组成，其含有量为5.4%，表明该糖肽的肽成分较少。该糖肽组成的测定方法简便快速，研究结果为阐明板蓝根糖肽的一级结构奠定了基础。

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