蒌蒿抗肿瘤作用活性部位的筛选

段和祥 黄宇枚 王栋 杨毅生 程奇珍 罗文艳

1.江西省药品检验检测研究院江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌330029；

2.南昌大学科学技术学院，江西南昌330029；3.南昌大学第四附属医院药剂科，江西南昌330003

蒌蒿抗肿瘤作用活性部位的筛选

段和祥1黄宇枚2王栋1杨毅生1程奇珍1罗文艳3

1.江西省药品检验检测研究院江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌330029；

2.南昌大学科学技术学院，江西南昌330029；3.南昌大学第四附属医院药剂科，江西南昌330003

目的采用体内外抗肿瘤实验方法，筛选蒌蒿抗肿瘤活性部位。方法以95%乙醇提取，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇提取，得不同的提取层。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法筛选出对人肝癌细胞（HepG2）细胞有良好增殖抑制作用的活性部位，并通过荷瘤小鼠模型考察活性部位对实体瘤生长的影响。结果蒌蒿的乙酸乙酯层对细胞增殖有显著的抑制作用，在10 g/L浓度时对细胞增殖抑制率为15.64%，当浓度为1000 g/L时对细胞增殖抑制率高达78.21%，其作用随着质量浓度的增加而增强。蒌蒿的乙酸乙酯层也对荷瘤小鼠有显著的抑制作用，当浓度为400 mg/kg时，对小鼠HepG2肉瘤的抑瘤率达71.63%。结论蒌蒿的乙酸乙酯层具有显著的体内、外抗肿瘤活性。

蒌蒿曰抗肿瘤曰活性部位

肿瘤是以细胞异常增殖为特点的一类疾病，常在机体局部形成肿块。肿瘤的种类繁多，且具有不同的生物学行为和临床表现。有些肿瘤生长迅速，侵袭力强，可从原发部位扩散到身体其他部位，严重影响机体健康，我们称之为恶性肿瘤，俗称癌症。它所带来的医疗费用及对患者和亲属产生的心理压力也是巨大的，是目前全球居民死亡率最高的疾病之一。

蒌蒿（Artemisia Selengensis Turcz.ex Bess.）为菊科蒿属植物，别名芦、蒿、芦蒿、水蒿、荑蒿等[1]。《神农本草经》将蒌蒿列为上品[2]，《本草纲目》将其收于草部第15卷[3]，为多年生草本植物，全草入药，性平、味甘，有止血消炎、镇咳化痰、开胃健脾、散寒除湿等功效。沈夕坤等[4]药理研究表明，蒌蒿可增强小鼠抗缺氧、抗疲劳、耐高温、耐低温能力，有较好的补益和免疫促进作用。张健等[5]从萎蒿叶中首次分离得到化合物11，13-dihydroatricarin，发现该化合物对B-16细胞（小鼠黑色素瘤细胞）和HL-60细胞（人原髓细胞白血病细胞）有显著的抑制活性，在浓度为1×10-5mol/L时，抑瘤率均到达90%以上，并且随着浓度的递减，抑制作用也逐渐减弱。蒌蒿对痢疾杆菌、大肠埃希菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和多种真菌也均有良好的抑制作用[6]。目前关于蒌蒿的研究，主要集中在抗菌、抗氧化、降压等活性物质基础和药理活性方面[7-13]，但蒌蒿抗肿瘤之功效，并未引起人们的足够重视。本试验对蒌蒿抗肿瘤的活性部位进行初步研究，为进一步筛选蒌蒿中抗肿瘤活性成分提供重要依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

N-1100旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社），AL104电子天平（梅特勒-托利多公司），NAPCO（美国Costar公司），VD53真空干燥箱（德国BIND公司），Synergguv超纯水仪（法国Millipore公司），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司），ST16R低温离心机（ThermoFishier公司）。

1.2 材料

蒌蒿采自江西省九江市鄱阳湖畔，经江西省食品药品检验所袁桂平主任中药师鉴定为菊科蒿属植物蒌蒿的全草。胰蛋白酶（中国食品药品检定所，批号：615-9605），小牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；RPMI 1640培养基（GIBCO）；二甲基亚砜（DMSO）、5-氟胞嘧啶（5-Fu）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、环磷酰胺（CTX）均购于Sigma公司，其他所用试剂均为分析纯。

1.3 细胞株及细胞培养

HepG2细胞来源于军事医学科学院放射与医学辐射学研究所，于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养HepG2细胞，在含有10%新生牛血（不含抗生素）的改良Eagle培养基（DMEN）培养基中生长，每3～4天以0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 实验动物

本实验所用小鼠为SPF级昆明（KM）小鼠，雌雄各半，3～4周龄，体重18～22 g，动物合格证号：4300470 0005991，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

2 方法

2.1 样品的制备

称取鲜蒌蒿36 kg，切碎，晾干，得22 kg，加95%乙醇100 kg，回流提取2 h，放出回流液，药渣再用95%乙醇100 kg，回流提取1.5 h，放出回流液，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05的流浸膏5 kg，加适量的水摇匀，得总提取物。该总提取物分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯与水饱和正丁醇提取，合并提取液，回收溶剂，依次得到石油醚层（85 g）、氯仿层（143 g）、乙酸乙酯层（261 g）和正丁醇层（776 g），备用。临用前再用二甲基亚砜分别稀释成10、100、1000 g/L。

2.2 细胞增殖抑制实验

采用MTT法，取对数生长期细胞稀释成1×104cells/mL，立即接种于96孔培养板上，每孔100μL，然后在规定的实验孔中加入不同浓度的样品培养基，每个平行3孔，对照组（5-Fu）加等体积溶剂，置37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养96 h，然后以3000 r/min速度离心5 min，每孔加0.2 mL新鲜配制的含有0.2 mL MTT的无血清培养基，在37℃继续培养4 h，再离心，倒出上清液，加0.2 mL二甲基亚砜溶解MTT甲臜沉淀，超声5 min，混匀，在酶标仪上于570 nm的波长处测定吸光度（A）。按（1-A样品组/A对照组）× 100%计算细胞增殖抑制率。

2.3 抗肿瘤活性体内试验

选用体重18～22 g的KM小鼠50只和生长良好的HepG2细胞，将HepG2细胞制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约5×106个细胞/只。随机分成5组，每组10只，接种24 h后开始给药。其中，乙酸乙酯层高、中、低剂量组（100、200、400 mg/kg），每日灌胃给药1次，共14次；环磷酰胺（CTX）阳性对照组腹腔注射给药（30 mg/kg），第1、8天给药，共给药2次；另设空白对照组，给予等体积生理盐水。停药后24 h处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重。按下列公式计算肿瘤抑制率：抑瘤率=（1-治疗组平均瘤重/空白对照组平均瘤重）×100%。

2.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 蒌蒿不同提取层对细胞增殖的抑制作用

结果表明，四种提取层对HepG2细胞增殖均有一定程度的抑制作用，其中，乙酸乙酯层的抑制作用最强，并且随着浓度的递增，抑制作用也逐渐增强，提示蒌蒿的乙酸乙酯层对肿瘤细胞具有较强的细胞毒作用。见表1。

3.2 乙酸乙酯层的抑瘤作用

结果表明，乙酸乙酯层表现出较强的肿瘤抑制作用，并且随着给药剂量的增加，瘤重逐渐下降，说明抑瘤率显著增强。再次确定了乙酸乙酯层为抗肿瘤的有效部位。见表2。

4 讨论

本实验对蒌蒿4种提取层进行了体外抗肿瘤细胞毒性试验，筛选出对HepG2有较好的细胞增殖抑制作用的有效部位。结果，乙酸乙酯层在1000 g/L时细胞增殖抑制率可达78.21%，说明乙酸乙酯层为其有效部位。石油醚层、氯仿层、水饱和正丁醇层对HepG2细胞增殖也有一定的抑制作用。体内抗肿瘤结果显示，乙酸乙酯层在100 mg/kg对小鼠HepG2肉瘤的抑制率为37.21%；当浓度增至400 mg/kg时，抑瘤率高达71.63%，说明乙酸乙酯层对HepG2细胞增殖有显著的抑制作用，并对小鼠移植性HepG2瘤有较强的抑制作用，随着给药剂量的增加，瘤重逐渐下降，抑瘤率明显升高。

表1 不同提取层细胞增殖抑制率比较

表2 乙酸乙酯层对小鼠HepG2肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）

抗肿瘤药物也是临床药物治疗中使用量较大的一类，在所有类别药物的不良反应中抗肿瘤药物不良反应报告占了很大比例[14]。寻找天然抗肿瘤活性成分是抗癌药物研究的一个重要途径，天然药物单体联合西药化疗治疗肿瘤疾病是又一重要途径[15]，利用这些天然活性物质进行结构修饰和优化，提高活性强度和选择性，改善物理化学性质和代谢动力学性质，是另一重要途径[16-17]。

鉴于蒿属植物在抗肿瘤方面的广泛研究与应用[18-28]，对蒌蒿抗肿瘤活性层进行分离、纯化及结构鉴定，再进行体外、体内试验，比较活性成分与抗肿瘤作用二者之间的量效和构效关系，为最终阐明蒌蒿的抗肿瘤活性化学物质基础，得到一系列抗肿瘤活性的活性成分，同时为研究和开发具有自主知识产权的高效低毒抗肿瘤药奠定基础。

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Screening of antitumor active fractions from Artemisia Selengensis Turcz.

DUANHexiang1HUANGYumei2WANGDong1YANGYisheng1CHENGQizhen1LUOWenyan3
1.Jiangxi Institute for Drug Control,Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality,Jiangxi Province,Nanchang 330029,China;2.College of Science and Technology,Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330029,China;3.Department of Pharmacy,the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi Province,Nanchang 330003,China

ObjectiveTo screen the antitumor active fraction from Artemisia selengensis Turcz.by antitumor experimental method in vitro and in vivo.MethodsArtemisia selengensis Turcz.were extracted with 95%ethanol eluent, then petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butyl alcohol extracted from the active fraction.The active fraction of good inhibitory effect on HepG2 cells proliferation was screened out by MTT assay.The inhibition effect of solid tumor by tumor-bearing mouse model was investigated.ResultsEthyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.could significantly inhibit the growth for cell proliferation,the inhibition rate was 15.64%at 10 g/L.The inhibition rate was 78.21%at 1000 g/L.With the increase of the concentration,inhibiting action increased.Ethyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.significant inhibition effect of solid tumor.When the concentration of 400 mg/kg for tumor bearing mouse inhibition rate was 71.63%.ConclusionEthyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.has significant anti-tumor activity in vitro and in vivo.

Artemisia Selengensis Turcz.;Antitumor;Active fraction

R284.1

A

1673-7210（2015）04（c）-0013-04

2015-01-21本文编辑：卫轲）

江西省青年科学基金资助项目（编号20122BAB 215044）；江西省卫生厅中医指导性计划项目（编号2013B014）。

段和祥（1980.5-），男，硕士研究生；研究方向：中药质量标准及物质基础研究。

罗文艳（1980.5-），女，硕士研究生；研究方向：医院药学。