表皮生长因子受体信号通路对慢性烟曲霉暴露哮喘大鼠气道重塑的影响

汪泽 高艳艳 刘永全 高福生▲

1.潍坊医学院，山东潍坊261053；2.潍坊医学院附属医院呼吸内科，山东潍坊261031

表皮生长因子受体信号通路对慢性烟曲霉暴露哮喘大鼠气道重塑的影响

汪泽1高艳艳2刘永全2高福生2▲

1.潍坊医学院，山东潍坊261053；2.潍坊医学院附属医院呼吸内科，山东潍坊261031

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）信号通路对慢性烟曲霉暴露哮喘大鼠气道重塑的影响。方法将30只Wistar雄性大鼠随机分为3组：A组（慢性哮喘大鼠），以卵清蛋白（OVA）系统致敏和反复激发方法制备大鼠慢性哮喘模型；B组（慢性哮喘大鼠+烟曲霉孢子吸入）：慢性哮喘大鼠经鼻吸入100μL烟曲霉孢子悬液（含1×104cfu/mL孢子），每周2次；C组[AG1478（EGFR抑制剂）预处理慢性哮喘大鼠+烟曲霉孢子吸入]：慢性哮喘大鼠经鼻吸入AG1478 3 mg/kg，每周1次，同时经鼻吸入100μL烟曲霉孢子悬液，每周2次。肺组织切片行苏木精-伊红（HE）、过碘酸希夫（PAS）、Masson三色染色，病理图像形态学测定分析，观察各组大鼠气道上皮细胞损伤脱落、杯状细胞增生及上皮下纤维化程度。免疫组化检测各组大鼠气道黏蛋白MUC5AC及气道上皮EGFR的表达。结果B组大鼠气道上皮损伤脱落[（28.50±7.50）%]、杯状细胞增生[（36.38±9.21）%]及上皮下胶原纤维沉积[（56.55±15.38）%]均高于A组[（6.34±1.81）%、（12.55±3.25）%、（18.23±5.21）%]（P＜0.01），C组上述指标[（7.32±2.11）%、（10.26±3.12）%、（16.34±4.25）%]与A组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；B组大鼠气道上皮细胞EGFR的表达水平（IOD值）（165±21）明显高于A组（56±18）（P＜0.01），B组和C组（155±12）大鼠间差异无统计学意义（P＞0.05）；B组大鼠气道上皮MUC5AC的表达水平（IOD值）（891±80）明显高于A组（212±46）（P＜0.01），C组（198±39）和A组大鼠间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论慢性烟曲霉暴露使哮喘大鼠气道上皮受损、杯状细胞增生、气道上皮下纤维化加重、上皮EGFR表达增加；应用AG1478抑制EGFR酪氨酸酶磷酸化可减轻哮喘大鼠气道杯状细胞增生及气道上皮下纤维化，下调气道黏蛋白MUC5AC的表达。表皮生长因子受体可能参与慢性烟曲霉暴露诱发的哮喘大鼠气道重塑。

表皮生长因子受体曰AG1478曰烟曲霉曰支气管哮喘曰气道重构

气道重塑是支气管哮喘主要的病理特征，主要表现为气道上皮杯状细胞增生、基底膜下胶原沉积及气道平滑肌肥厚等[1]。近年研究表明，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为气道上皮细胞功能的调控者，在气道上皮细胞损伤和修复及气道重塑中均起到重要作用[2]。当气道上皮细胞损伤后，产生表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α（TGF-α）等配体与EGFR结合后活化，激活细胞外信号调节激酶传导通路，上调呼吸道黏蛋白MUC5AC表达，诱导杯状细胞过分增生和呼吸道黏液过度分泌[3]。烟曲霉孢子广泛分布于大气环境中，是日常生活中最常见的气传过敏原之一。流行病学资料显示，周围环境中烟曲霉及其孢子的浓度与哮喘发作、死亡之间在季节、时间上密切相关[4]。笔者前期研究发现，慢性烟曲霉暴露可加重哮喘大鼠气道炎症反应和气道重塑，上调气道上皮细胞EGFR和黏蛋白MUC5AC的表达，加重气道上皮杯状细胞增生，使气道阻力和气道高反应性进行性加重[5-7]。但是，慢性烟曲霉暴露是否通过EGFR信号传导通路来加重哮喘大鼠气道重塑，目前尚不明确。笔者对此进行了研究，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康清洁级雄性Wistar大鼠30只，购自山东鲁抗[SCXK（鲁）2013-0001]，4～5周龄，体重150～170 g，实验1周前饲养于潍坊医学院动物房内，恒温清洁环境，标准饲料，自由取水。

1.1.2 试剂卵清蛋白（ovalbumin，OVA）干粉（美国santa Cruz公司）、AG1478（美国santa Cruz公司）、氢氧化铝（淄博昌丰化工）、灭活百日咳杆菌菌苗（上海生物研究所）、沙氏琼脂平板培养基（青岛海博生物）、吐温80（上海博光生物公司）、过碘酸希夫（PAS）染色套装（上海虹桥医用试剂研究所）、小鼠抗大鼠MUC5AC单抗（美国Neomarker公司）、羊抗小鼠IgG-SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司）、兔抗EGFR多抗（美国Cell signaling公司）、HRP-羊抗兔IgG抗体（美国Jackson公司）、羊抗兔IgG-SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司）。

1.1.3 主要仪器雾化器（boy037G6000型，德国Pari公司）、定做有机玻璃雾化箱；Axioplan显微镜（德国蔡司公司）、AxioCam照相机（德国蔡司公司）；生物图像分析系统（Image Pro Plus，美国Media Cybernetics公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组将30只Wistar雄性大鼠随机分为三组：A组（慢性哮喘大鼠），用OVA致敏并反复激发制备大鼠慢性哮喘模型；B组（慢性哮喘大鼠+烟曲霉孢子吸入）：哮喘大鼠经鼻吸入100μL烟曲霉孢子悬液（含1×104cfu/mL孢子），每周2次；C组[AG1478（EGFR抑制剂）预处理慢性哮喘大鼠+烟曲霉孢子吸入]：慢性哮喘大鼠经鼻吸入AG1478 3 mg/kg，每周1次，同时经鼻吸入100μL烟曲霉孢子悬液，每周2次。

1.2.2 建立慢性哮喘模型参考Palmans等[8]的方法，配制OVA 1 mg+氢氧化铝100 mg+生理盐水1 mL混悬液（现用现配），分别于第1、8天在大鼠腹、前足跖、两腹股沟，共4点，每点皮下0.2 mL、腹腔0.2 mL，并腹腔注射灭活百日咳杆菌菌苗，检测致敏有效性，每次1 mL，共2次。从第15天开始至第57天，共6周，将大鼠放于定制有机玻璃箱内，雾化吸入1%OVA生理盐水溶液，3次/周，每次30 min。

1.2.3 AG1478预处理大鼠从第15天开始给予C组大鼠经鼻吸入AG1478 3 mg/kg，每周1次（与雾化吸入不同天），共5周。

1.2.4 大鼠经鼻吸入烟曲霉孢子参考文献[9-10]方法从第63天起，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，并将其垂直挂于木板上，从鼻孔处滴入100μL烟曲霉孢子悬液后维持垂直体位10 min。每周2次，共5周。

1.2.5 动物标本处理末次操作24 h后，上述方法麻醉大鼠，腹主动脉放血处死大鼠，剖开胸腔，将右肺门根部结扎；取右肺上叶置液氮瓶中保存待用。将右肺下叶置于4%多聚甲醛中固定72 h，脱水、石蜡包埋后5μm厚切片，行苏木精-伊红（HE）染色、PAS、Masson三色染色、MUC5AC及EGFR免疫组织化学染色。

1.2.6 肺组织病理图象的形态学测量及分析在Axioplan显微镜下放大100～1000倍，观察染色肺组织病理切片，用AxioCam照相机采集图像，应用Image Pro-Plus software 5.0软件进行肺组织病理图象的形态学测量及分析[11-13]。每种染色切片都随机从每组中取不同大鼠的5张肺组织切片，测量和分析所有直径250～2000μm且管腔最短径/最长径≥0.6的支气管。取HE染色切片，测量无完整纤毛细胞或杯状细胞覆盖的上皮长度及支气管上皮内径的周长，用脱落上皮长度与上皮内径周长的百分比示上皮细胞脱落情况。取PAS染色切片，测量被PAS染成玫瑰红色面积以及基底膜间区域总面积和气道上皮表面面积，用PAS染色后面积占该区域总面积的百分比表示杯状细胞增生程度。取Masson三色染色切片，测量气道上皮基底膜下20μm区域内染成蓝色的总面积及非细胞部分的面积，用染成蓝色部分的面积占该区域总面积的百分比表示上皮下胶原纤维沉积程度。

1.2.7 大鼠肺组织切片MUC5AC免疫组化染色右肺下叶石蜡切片行免疫组化染色，一抗为小鼠抗大鼠MUC5AC单抗，实验浓度1∶200，二抗羊抗小鼠IgG，实验浓度1∶2000，辣根过氧化酶（DAB）显色后苏木精复染。以生理盐水作为阴性对照。结果：将气道上皮细胞胞浆内显示棕黄色的颗粒作为阳性结果。Axioplan显微镜下放大200倍，AxioCam照相机采集图像，每只大鼠在直径600～1000μm细支气管区，随机各选5个视野，软件计算阳性结果信号累积光密度（integrated opticaldensity，IOD）。以MUC5AC染色阳性的IOD表示表达水平。

1.2.8 大鼠肺组织切片EGFR免疫组化染色右肺下叶石蜡切片，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（streptavidin biotin-peroxidasecomplexmethod，SABC）法进行免疫组化染色，一抗为兔抗EGFR多抗，实验浓度为1∶100，二抗实验浓度为1∶2000，DAB显色后苏木精复染。以生理盐水作为阴性对照。气道上皮细胞棕黄色颗粒作为阳性结果。在Axioplan显微镜下放大200倍，AxioCam照相机采集图像，每只大鼠在直径600～1000μm的细支气管区，随机选取5个视野，Image-pro plus 5.0软件测定阳性信号IOD。

1.3 统计学方法

数据处理采用SPSS 17.0统计软件包，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，统计分析采用单因素方差分析，组间均数比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠气道重塑程度

B组大鼠气道上皮损伤脱落、杯状细胞增生及上皮下胶原纤维沉积程度均明显高于A组（P＜0.01），C组和A组大鼠间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1～3（封三）。

表1 各组大鼠气道重塑程度（x±s，n=10）

2.2 各组大鼠气道上皮细胞EGFR及气道上皮MUC5AC的表达

B、C组大鼠气道上皮细胞EGFR的表达水平明显高于A组（P＜0.01），B组和C组大鼠间差异无统计学意义（P＞0.05），B组大鼠气道上皮MUC5AC表达水平明显高于A组（P＜0.01），C组和A组大鼠间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2及图4～5（封三）。

表2 各组大鼠气道上皮细胞EGFR及上皮MUC5AC的表达（x±s，n=10）

3 讨论

目前，临床上在治疗重症支气管哮喘的过程中，真菌暴露这一危险因素越来越受到人们的关注。健康的呼吸道上皮细胞可作为人体内外环境之间的完整屏障，阻挡吸入的真菌及其孢子等多种抗原大分子物质通过。哮喘患者的气道发生多种病理改变，有利于烟曲霉等真菌孢子在呼吸道黏膜黏附，甚至造成侵袭性感染。气道重塑是支气管哮喘患者最重的病理特征之一[14]，早在1992年，Huber和Koessler便提出了这一概念，主要指气道平滑肌增生和肥大、基底膜增厚、细胞外基质过度沉积、上皮下纤维化等气道病理学改变[1]。随后，在研究过程中人们发现，EGFR作为一种多功能糖蛋白，在正常人和无病原体的许多啮齿动物的气道上皮成散在表达，属于受体酪氨酸激酶（RTKS），由三个区域组成，其中胞外区与配体结合后激活，并通过胞内侧激酶级联反应将信号由胞外传至胞内，进而发挥一系列生物学作用[15-16]。有研究表明，EGFR是气道上皮细胞功能的调控者，在气道上皮细胞损伤和修复及气道重构中起重要作用[3]。AG1478是人工合成的小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂，对EGFR具有高度选择性，可通过阻断EGFR介导的信号传导通路，抑制慢性烟曲霉暴露的哮喘大鼠气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、血管平滑肌细胞的增殖，并可进一步诱导细胞凋亡[17-18]。

本实验中，笔者探讨了EGFR信号通路在烟曲霉暴露哮喘大鼠气道重塑中的影响，发现长时间地吸入低浓度的烟曲霉孢子后，哮喘大鼠气道上皮损伤加重，杯状细胞增生、气道上皮下胶原沉积明显，免疫组化结果示气道上皮EGFR及气道黏蛋白MUC5AC表达上调。应用AG1478高度选择性阻断EGFR信号传导通路后，慢性烟曲霉暴露的哮喘大鼠气道上皮细胞病理改变明显减轻，黏蛋白MUC5AC表达下调，减轻了气道黏液过度分泌。以上结果显示，阻断EGFR信号通路可抑制慢性烟曲霉暴露诱导的支气管哮喘大鼠的气道重塑，提示阻断EGFR信号传导通路可能是真菌相关哮喘治疗的新靶点。EGFR的下游信号分子及信号转导通路有待进一步研究。

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Effects of epidermal growth factor receptor signal pathway on the airway remodeling induced by chronic Aspergillus fumigatus exposure in rats with asthma

WANGZe1GAOYanyan2LIUYongquan2GAOFusheng2▲
1.Weifang Medical College,Shandong Province,Weifang 261053,China;2.Department of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital of Weifang Medical College,Shandong Province,Weifang 261031,China

ObjectiveTo investigate the effects of epidermal growth factor receptor(EGFR)signal pathway on the airway remodeling induced by chronic A spergillus fumigatus(A.fumigatus)exposure in rats with asthma.Methods30 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups.Rats in group A were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA)to set up chronic asthma model.Chronic asthma rats in group B were given intranasal A.fumigates spores inhalation twice a week for 5 weeks.Chronic asthma rats in group C were given intranasal EGFR inhibitor AG1478 inhalation once a week prior to A.fumigates spores inhalation for 5 weeks.Lung sections were stained with hematoxylin and eosin(HE),periodic acid Schiff(PAS),and Masson trichrome,and the images were analyzed morphometrically to evaluate the airway epithelial detachment,goblet cell hyperplasia and subepithelial collagen deposition in 3 groups of rats.The expression of MUC5AC and EGFR in the airways was detected and analyzed by immunohistochemistry.ResultsThe airway epithelial detachment[(28.50±7.50)%],goblet cell hyperplasia[(36.38±9.21)%]and subepithelial collagen deposition[(56.55±15.38)%]in group B were all higher than those in group A[(6.34±1.81)%,(12.55±3.25)%and (18.23±5.21)%](P＜0.01).No differences were found in above indexes between group C[(7.32±2.11)%,(10.26±3.12)% and(16.34±4.25)%]and group A(P＞0.05).The expression of EGFR in the airways(IOD values)in group B(165±21)was higher than that in group A(56±18)(P＜0.01),no difference was found between group B and group C(155±12)(P＞0.05).The expression of MUC5AC in the airways(IOD values)in group B(891±80)was higher than that in group A(212±46)(P＜0.01).No difference was found between group C(198±39)and group A(P＞0.05).ConclusionChronic A.fumigates exposure induced aggravation of airway epithelial detachment,goblet cell hyperplasia and subepithelial collagen deposition,and upregulated MUC5AC and EGFR expression in chronic asthma rats.EGFR inhibitor AG1478 inhalation downregulated airway epithelial detachment,goblet cell hyperplasia,subepithelial collagen deposition and MUC5AC expression in chronic asthma rats.EGFR signal pathway may play a role in the airway remodeling induced by chronic A.fumigates exposure in chronic asthma rats.

Epidermal growth factor receptor;AG1478;Asthma;Aspergillus fumigatus;Airway remodeling

R562.25

A

1673-7210（2015）04（c）-0004-04

2015-01-02本文编辑：张瑜杰）

山东省自然科学基金资助项目（编号ZR2012H M094）。

▲通讯作者