青蛤酶解多肽体外抗氧化活性的研究

赵莎莎，潘 欣，赵玉勤，闫海强，杨最素

（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江舟山 316022）

青蛤酶解多肽体外抗氧化活性的研究

赵莎莎，潘 欣，赵玉勤，闫海强，杨最素

（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江舟山 316022）

以青蛤内脏为原料，应用碱性蛋白酶对其进行酶解，以DPPH清除率为指标，采用正交实验确定碱性蛋白酶酶解的最佳条件，测定酶解多肽对DPPH清除率、超氧自由基清除率、螯合力和还原铁的能力；使用琼脂糖凝胶电泳检测多肽对羟自由基诱导损伤的pBR322 DNA的保护作用，使用SDS-PAGE电泳测定青蛤多肽的分子量。结果表明青蛤内脏碱性蛋白酶酶解的最佳条件为温度50℃、时间4 h、酶添加量2 000 μ/g、pH 9。得到的青蛤多肽在浓度为5 mg/mL时，DPPH的清除率为91.24%，羟自由基的清除率为62.83%，Fe2+的螯合力为61.13%，还原力为0.331。青蛤多肽对羟自由基诱导损伤的pBR322 DNA有一定的保护作用；该多肽的分子量范围为15～25 kDa。因此青蛤内脏经碱性蛋白酶酶解得到的多肽具有较好的抗氧化活性。

青蛤；碱性蛋白酶；酶解多肽；抗氧化性

青蛤Cyclina sinensis(Gmelin)属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科，俗称黑蛤、圆蛤、铁蛤等，分布于我国沿海潮间带的泥砂滩中，是我国沿海地区常见的一种贝类。青蛤肉质鲜美、营养丰富，除有较高的食用价值之外还是一种重要的海洋药物。《神农本草经》、《本草纲目》以及《本草纲目拾遗》均将青蛤作为一种常用药物收录在其中。近年来研究表明，青蛤肉提取物能增加老年大鼠脾中的淋巴细胞、巨噬细胞活性及淋巴结中的巨噬细胞活性，对提高细胞免疫应答及机体正常免疫力等有重要的作用[1]；粗青蛤多糖在体外具有抗氧化活性，对四氯化碳诱导的小鼠肝毒性模型具有重要的保护作用[2]。而有关青蛤酶解多肽的抗氧化活性实验报道不多。本文以新鲜青蛤内脏为原料，利用酶解所得的水解液进行体外抗氧化实验，并探讨其对羟自由基诱导损伤pBR322 DNA的保护作用。

1 材料与仪器

1.1 实验原料及试剂

新鲜青蛤购于舟山南珍市场，去壳取内脏，-20℃冷冻保存备用；碱性蛋白酶购于北京亚太恒信生物科技有限公司；邻二氮菲、DPPH、铁氰化钾购自上海晶纯试剂有限公司；其余试剂为分析纯均购置国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

BSA1245型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；CF16RX高速冷冻离心机（日立公司）；UV-1600PC型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；SSW型微电脑电热恒温水槽（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYCZ-28C型电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1 酶解工艺

考虑1（温度）、2（时间）、3（酶活添加量）、4（pH）四个因素，每个因素选三个水平进行正交实验，比较碱性蛋白酶在不同水解条件下的DPPH自由基清除率，从而确定碱性蛋白酶的最佳水解条件（表1）。酶解液的制备工艺是：青蛤肉脏用匀浆机破碎，按1∶3比例加入蒸馏水，用一定浓度的盐酸和氢氧化钠溶液调节匀浆液的pH值，加入碱性蛋白酶进行酶解，实验结束后用沸水灭活10 min，冷却至室温，10 000 r/min离心10 min，取上清液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，测定DPPH自由基清除率。

表1 碱性蛋白酶因素与水平Tab.1 Factors and levels of Alcalase

2.2 对DPPH自由基的清除作用

按照文献[3]进行DPPH自由基清除活性测定。DPPH浓度0.1 mmol/L（无水乙醇溶解）避光保存，方法是1 mL样品+1 mLDPPH，混匀后，避光保存30 min，4 000 r/min离心10 min，517 nm处测吸光度Ai。同时测1 mL无水乙醇+1 mL样品混合的测吸光度Aj，与1 mL DPPH+1 mL水混合测吸光度Ac。计算公式为

DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

2.3 对羟自由基清除率的测定

[4]所述方法，并做适当调整。取0.75mmol/L邻二氮菲1mL于试管中，依次加入pH值为7.4的PBS2mL，样品液1mL，振荡混匀后加浓度为0.75 mol/L的硫酸亚铁1mL，充分混匀，再加入0.03%双氧水1mL，37℃水浴1 h，在536 nm处测其吸光度As；空白组用水代替双氧水，为Ab；损伤组用水代替样品，为Ap。

清除率（%）=[（As-Ap）/(Ab-Ap)]×100%

2.4 对Fe2+离子的螯合作用

实验方法参照文献[5]，在干净的具塞试管中依次加入不同质量浓度的受试样品(1～5 mg/mL)0.5 mL，20 μM FeCl2溶液1 mL，混匀后加入0.5 mM ferrozine 1 mL，25℃反应20 min后于562 nm处测定吸光度Ab；空白组以水代替样品，为Ac。

螯合力（%）=（1-Ab/Ac）×100%

2.5 还原能力的测定

参照文献[6]方法并略有改动。将干净的具塞试管中分别依次加入样品1 mL，另加入1 mL Tris-HCl（0.2 mol/L，pH为6.6）及1%铁氰化钾2.5 mL，混匀后于50℃水浴20 min，然后加入10%三氯乙酸1.5 mL，混匀后3 000 r/min离心10 min。准确移取上清液2.0 mL，加入蒸馏水2.0 mL以及0.1%三氯化铁0.5 mL，混匀后静置10 min，于700 nm处测定吸光度值A，吸光度值越大表明还原力越强。

2.6 对羟自由基诱导损伤的pBR322 DNA保护作用

采用文献[7]的实验方法评价青蛤多肽对羟基自由基诱导的DNA损伤的保护作用。将0.5 μL的pBR322 DNA溶解在3 μL浓度为50 mmol/L的PBS液中，并转移到微量离心管中，同时加入2 mmol/L新鲜配制的FeSO4溶液3 μL和不同浓度的青蛤多肽溶液2 μL，再加入4 μL质量分数30%的H2O2溶液，混合物在37°C下反应30 min后，加入DNA上样缓冲液（荧光）结束反应。空白组仅为pBR322DNA和上样缓冲液，各组点样于1%琼脂糖凝胶，100 V电压条件下电泳70 min。利用凝胶成像系统观察电泳结果，并拍摄照片。

2.7 SDS-PAGE分析多肽的电泳行为

用15%的分离胶、5%的浓缩胶灌制SDS-PAGE凝胶。将15%的分离胶加入电泳玻璃板中并用水把分离胶表面压平，20 min后将水倒掉，灌入5%的浓缩胶。上样量为0.01 mL，接通电源电压调至90 V，待样品进入分离胶后调至130 V。待样品到达距离分离胶底部0.5 cm时关闭电源，取出凝胶在染色液中染色1 h，最后脱色4 h，拍照。

3 结果与分析

3.1 正交实验结果

本实验以DPPH清除率为指标，进行四因素三水平L9（34）的正交实验，结果见表2。由表2中可知，影响碱性蛋白酶水解多肽DPPH清除率的各因素排列顺序为D＞A＞C＞B，即pH值影响最大，水解时间影响最小。因此碱性蛋白酶水解青蛤获得多肽的最佳水解条件为A3B1C3D1。选择的温度为50℃、时间4 h、酶活添加量量2 000 u/g、pH 9作为最佳水解条件。

表2 碱性蛋白酶酶解青蛤内脏正交实验结果Tab.2 Results of L16(45)orthogonal test of Alcalas aboutC.sineensis'sentrails

3.2 酶解多肽对DPPH自由基的清除率

将最佳酶解条件下得到的水解物冷冻干燥，检测质量浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL时的水解物对DPPH自由基的清除率。结果如图1所示，青蛤碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而增大。当浓度为5 mg/mL时，清除率达到91.24%；当青蛤多肽对DPPH的清除能力达50%时，所需的多肽质量浓度为1.57 mg/mL。

图1 青蛤酶解多肽对DPPH自由基清除率Fig.1 DPPHradical scavenging activities ofC.sinensispeptides

3.3 酶解多肽对羟自由基清除率

样品浓度设置同3.2，检测其对羟自由基的清除率，结果如图2所示。不同浓度的碱性蛋白酶水解物对羟自由基均有一定程度的清除作用，并且随着浓度升高，清除率增大，但酶解多肽对羟自由基的清除率低于DPPH，当浓度为5 mg/mL时，清除率为62.83%。当青蛤酶解多肽对羟自由基的清除率达50%时，所需的多肽质量浓度为2.1 mg/mL。

图2 青蛤酶解多肽对羟自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activities ofC.sinensispeptides

3.4 酶解多肽对Fe2+的螯合作用

样品浓度设置同3.2，检测酶解多肽对Fe2+离子的螯合作用，结果如图3所示。随着水解物浓度的升高，螯合力增大，当浓度为5 mg/mL时，螯合力为61.13%。Fe2+的螯合能力的EC50为 2.75 mg/mL。

图3 青蛤酶解多肽对Fe2+离子的螯合作用Fig.3 TheFe2+chelationofC.sinensispeptides

3.5 酶解多肽的还原能力

样品浓度设置同3.2，分别检测其还原力。根据还原力的测定方法，在700 nm处的吸光度越大，水解物的还原能力越强。从图4可知，在所设置的浓度范围内，随着浓度增大，还原力增强，即呈现浓度依赖性。

图4 青蛤酶解多肽的还原力Fig.4 ThereducingpowersofC.sinensispeptides

3.6 酶解多肽对羟自由基诱导损伤pBR322 DNA的保护作用

当DNA暴露在羟自由基中时被裂解成三种形式—超螺旋结构（supercoil DNA，SC-DNA）、开环结构（open cycle DNA，OC-DNA）和线性结构形式。开环结构代表单链DNA断裂，线性结构表示双链断裂[8]。青蛤酶解多肽对羟自由基诱导的DNA氧化损伤的保护作用如图5所示。从图中可以看出，未被羟自由基损伤的原质粒pBR322DNA（Blank）几乎全部呈超螺旋结构的DNA，而对照组（control）即加入Fe2+和H2O2反应后，DNA几乎全部呈开环状态，表明羟自由基对pBR322DNA有损伤作用。但加入青蛤酶解多肽后，超螺旋结构的DNA逐渐增多，而开环结构的DNA逐渐减少，并且随着样品浓度逐渐增加，以超螺旋形式存在的DNA明显增多。而凝胶上并未出现线性条带，这可能是该实验中产生的羟自由基作用程度不足以使质粒DNA双链断裂[9]。这些结果表明，该多肽能显著地抑制羟自由基诱导的DNA氧化损伤，可能与该多肽可以阻止Fe2+和H2O2反应，并通过提供氢原子和电子而直接清除羟自由基，进而保护质粒DNA不被损伤有关[10]。

图5 青蛤多肽抗羟自由基诱导pBR322DNA损伤能力的琼脂糖凝胶电泳图Fig.5 The agarose gel electrophoresis ofC. sinensispeptides to hydroxyl radical-induced pBR322 DNA breaks

3.7 青蛤多肽分子量的测定

青蛤多肽分子量的测定如图6所示，酶解物组分经SDS-PAGE电泳，染色、脱色后显示为单一条带，且条带分子量在15～25 kDa之间显示。

图6 青蛤酶解多肽的SDSPAGE电泳图Fig.6 The SDS-PAGE gels ofC.sinensispeptides

4 结论

本实验采用正交实验探讨碱性蛋白酶对青蛤进行酶解时各因素及水平对抗氧化活性的影响，结果显示，水解物抗氧化活性最大的影响因素为pH值，最小的影响因素为水解时间，且当温度为50℃、时间为4 h、加酶量为2 000 μ/g、pH为9时，水解多肽的DPPH清除率最大。在最佳抗氧化水解条件下得到的多肽，对羟自由基、DPPH自由基均有一定的清除活性，具有较好的Fe2+离子螯合力和还原性，且对羟自由基诱导损伤的pBR322 DNA具有保护作用，该多肽的分子量在15～25 kDa之间。下步将进一步对该多肽进行分离纯化，并进行动物体内实验，有望开发为抗氧化保健食品。

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Study on the Antioxidant Activity and its Characteristic of Cyclina sinensis in Vitro

ZHAO Sha-sha,PAN Xin,ZHAO Yu-Qin,et al

(School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products,Zhoushan 316022,China)

In this study,Cyclina sinensisviscera were used to study its antioxidant activity and characteristic. The orthogonal experiment was adopted to determine the optimal hydrolysis conditions ofC.sinensispolypeptide which effected by alkaline protease,and the ability of hydrolysates on DPPH free radical scavenging was determined,as well as the ability of scavenging superoxide free radical,chelating ability and the ability of reducing iron.The protective effect of the peptides against hydroxyl-radical-induced DNA damage was measured by DNA agarose electrophoresis and the molecular weight was detected by SDS-PAGE.The results showed that the optimum conditions of alkaline protease for hydrolysis were as follows∶temperature 50 oC,hydrolysis time 4 h,E/S 2000 U/g protein and Ph 9.0.As theC.sinensispolypeptide was 5 mg/mL,the rate of DPPH free radical scavenging was 91.24%,and that of the scavenging superoxide free radical,the ability of reduced iron were 62.83% and 61.13%,and the reducing power was 0.331.So,the polypeptide had a protective effect against DNA damageinduced by hydroxyl radical.And,it’s molecular weight was 15-25 kDa.The polypeptide isolated fromC.sinensisexhibited an obvious capability of anti oxidation.

Cyclina sinensis;alkaline protease;polypeptide;anti oxidation

R282.77

A

1008－830X(2015)01－0045－05

2014-07-10

浙江省自然科学基金项目（LY12C20005）

赵莎莎（1990-），女，山东惠民人，硕士研究生，研究方向：海洋功能食品.E-mail:zhaoshasha1216@126.com

杨最素（1967-），女，浙江定海人，副教授，研究方向：海洋功能食品.E-mail:yangzs87@163.com