正交试验法优选黄花宁神颗粒的水提工艺

向 蓉 ，张瑞堂，康玉龙，李生文，金永新#(.甘肃省第二人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000;.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000)

抑郁症是一种以持续情绪低落为主要症状的疾病，随着现代生活节奏的加快，生活和工作压力的增大，其已成为除心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病之外又一影响人类健康的常见、多发病［1］。目前，抗抑郁治疗主要以化学药为主，有效率为60% ～70%，且不良反应多［2］。中药具有多途径、多靶点、综合治疗的特点，因此，有很好的治疗优势［3］。黄花宁神颗粒源于临床经验方，由黄花、合欢花、石菖蒲、茯神、百合、甘草、大枣等12 味中药按比例组成，具有疏肝解郁、醒脑开窍的功效，临床一直以传统煎剂应用，具有质量不易控制、服用量大、携带不便等缺点［4］。为了更好地控制质量，保证疗效，对其进行水提取工艺优选，将其开发成复方新制剂。本研究采用L9(34)正交试验设计，以出膏率和槲皮苷含量为评价指标，结合生产实际，综合考虑确定黄花宁神颗粒的最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器:LC-10AT 液相色谱仪、SPD-M10AVP 二极管阵列检测器、CBM-10A 系统控制器(日本Shimadzu 公司)，RX-95 热空气消毒箱(连云港市医疗设备厂)，ALC-210.4 电子分析天平(ACCULAB Sartorius 公司)，B1210E-MT 超声仪(美国Brason Ultrsonics 公司)，800 型离心沉淀器(上海手术器械厂)等。

1.1.2 试剂:槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号:111538-200504)，甲醇为色谱纯(天津市光复精细化工研究所)，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 正交试验设计:根据预试验及文献［5-6］，以出膏率和槲皮苷含量为综合评价指标，选择加水量(A，倍数)、回流时间(B，h)、回流次数(C，次)为考察因素，每个因素取3 个水平，采用L9(34)正交设计进行试验，见表1。

表1 提取工艺因素与水平Tab 1 Factors and levels of extraction technology

1.2.2 样品制备:取处方12 味中药适量，加水浸泡30 min 后按L9(34)正交设计表(见表2)进行回流提取，过滤，合并提取液，静置过夜，滤过，浓缩定容成50 ml 浸膏，备用。

1.2.3 出膏率测定:精密吸取按L9(34)正交设计表进行提取的样品浸膏20 ml，置于105 ℃干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒质量，迅速称定质量，按下式计算出膏率:出膏率=干浸膏质量×5/(中药质量×2)×100%。

1.2.4 槲皮苷含量测定［7-8］:(1)色谱条件:色谱柱为Phenomenex C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为甲醇∶0.1%磷酸溶液(45∶55，V∶V);检测波长为256 nm;流速为1.0 ml/min;进样量为15 μl;柱温为常温。(2)标准曲线及线性关系考察:精密称取槲皮苷对照品11.0 mg，溶解并定量转移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取1 ml置于10 ml 容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，得质量浓度为110 μg/ml 的对照品溶液。精密吸取槲皮苷对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl，分别进样测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线。(3)方法学验证:精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，分别进样测定峰面积。在稳定性试验中分别于0、2、4、6、8、12 h 取样分析，测定槲皮苷峰面积，计算RSD。(4)样品含量测定:分别取“1.2.3”项下按正交试验所得干膏1 g，研细，精密称定，加甲醇适量，超声提取，离心10 min，取上清液，用甲醇稀释至25 ml，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品，分别进样测定峰面积，代入回归方程计算槲皮苷含量。

1.2.5 工艺验证:根据正交试验结果，按确定的最佳工艺条件投料3 批进行工艺验证，测定槲皮苷峰面积，计算槲皮苷质量分数。

2 结果

2.1 出膏率测定结果

出膏率测定结果见表2。

表2 提取工艺正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test of extraction technology

2.2 标准曲线及线性关系

回归方程为Y=4 ×106X-92 749，r=0.999 8，结果表明槲皮苷的量在0.22 ～1.32 μg 与峰面积呈良好线性关系。

2.3 方法学验证结果

阴性对照无干扰，见图1。日内和日间精密度试验表明，所得RSD均＜2.05%(n=5);对同一供试品溶液中槲皮苷含量的重复性试验表明，RSD=2.14%(n=6);稳定性试验计算得RSD= 1.87% (n= 6)。平均回收率为98.83%，RSD=2.83%(n=6)。表明方法的专属性、精密度、重复性和稳定性良好，可用于样品中槲皮苷含量的测定。

图1 黄花宁神颗粒及对照品高效液相色谱图Fig 1 HPLC of Huanghua Ningshen granules and its standard substance

2.4 结果分析

正交试验结果见表2，方差分析见表3。结果表明，以出膏率为考察指标，各因素影响程度由大至小依次为回流次数(C)、回流时间(B)、加水量(A)，最佳水提工艺条件为A3B3C3，即加10 倍量的水，回流1.5 h，回流3 次;以槲皮苷含量为考察指标，各因素影响程度由大至小依次为加水量(A)、回流时间(B)、回流次数(C)，最佳水提工艺条件为A2B3C2，即加8 倍量的水，回流1.5 h，回流2 次。因加水量对槲皮苷的影响程度最大，对出膏率影响最小;在有效成分明确的前提下主要考虑槲皮苷的含量;结合大生产中节约成本的角度，所以经综合考虑确定选择提取条件为A2B3C2，即加8 倍量的水，回流1.5 h，回流2 次。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of analysis of variance

2.5 工艺验证结果

槲皮苷质量分数分别为0.174 9、0.177 1、0.168 1 mg/g，RSD=2.70%(n=3)，表明提取工艺稳定，质量可控。

3 讨论

黄花宁神颗粒处方中君药黄花又称萱草，其水提物对小鼠抑郁症的强迫游泳模型、悬尾模型和拮抗利血平所致的抑郁症模型均有显著治疗作用［9］，水提物较醇提物减少小白鼠自发活动的作用更为明显［10］;合欢花水提物对“行为绝望”动物模型具有明显抗抑郁作用［11-12］。临床一直以煎剂应用，故对其进行水提取工艺优选。

黄花含有的金丝桃苷具有抗抑郁作用［13-14］，合欢花中槲皮苷具有镇静、催眠作用［15-16］。预试验中因金丝桃苷与黄花中另一成分芦丁保留时间相同，很难快速分离，而槲皮苷可以快速分离，且与杂质峰分离度好，阴性对照无干扰，故选择槲皮苷为优化提取工艺正交试验考察指标之一。

中药提取的出膏率与制剂质量和生产密切相关，故本研究以出膏率和槲皮苷含量作为考察指标，控制黄花宁神颗粒质量，综合考虑最终选择提取条件为A2B3C2，即加8 倍量的水，回流1.5 h，回流2 次，经过工艺验证，该提取工艺合理，稳定可行，可用于黄花宁神颗粒的研制。

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