三黄泻心汤不同提取溶媒抑菌活性研究

孙 涛 ，张洪峰，刘 璐(邯郸市中心医院药剂科住院部药房，河北 邯郸 056001)

三黄泻心汤出自医圣张仲景的《金匮要略》，由黄连、黄芩和大黄组成［1］。功能主治为清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所致的身热烦躁、目赤口疮、咽喉牙龈肿痛、大便秘结，以及咽炎、扁桃体、牙龈炎见上述证候者。本研究采用水和乙醇2 种提取工艺对该方抑菌活性进行比较，旨在为以其为方剂的中成药生产工艺的改进及开发新药提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料

中药材饮片黄连(Coptis chinensis)、黄芩(Scutellaria baicalensis)和大黄(Rheum palmatum)均购于邯郸医药大厦。

1.2 供试菌株

革兰阴性菌为大肠埃希菌(Escherichia coil)，革兰阳性菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，均由河北省邯郸市中心医院检验科保存。

1.3 培养基

LB 固体和液体培养基，配方:酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠(NaCl)10 g，水1 000 ml，固体培养基加琼脂粉18 g，调节pH 值为7.2 ±0.1，121 ℃灭菌20 min。

1.4 仪器与试剂

DZF-6050 型真空干燥箱(梅特勒-托利多仪器公司)、FAB 型电子天平(上海精密仪器厂)、DXF-200 型粉碎机(长沙常宏制药机械设备厂)、RE-52C 型旋转蒸发器(上海勒顿实业有限公司)、SHD 型循环水式多用真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂)、ZWYR-211C 型摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)、SJ-CJ-2FDQ 型超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)、HWS-050 恒温恒湿培养箱(金坛市华城创威实验仪器厂)、YX-400A 型电热蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司);75%乙醇(分析纯，北京化工厂)等，水为纯净水。

1.5 供试药品制备

将中药材黄连、黄芩和大黄于25 ℃烘干，粉碎。三黄泻心汤组方:黄连、黄芩、大黄按1∶1∶2比例组成。三黄泻心汤组方分别用水和75%乙醇提取，黄连用75%乙醇提取，分别室温提取3 次，合并各自全部提取液，减压浓缩得到提取物，使每毫升提取液含黄连生药材1 g。

1.6 测定抑菌活性

采用纸片扩散法，在无菌条件下，在直径为6.0 mm 的圆形滤纸片上滴注6 μl 供试溶液，在超净工作台中吹干后将该滤纸片均匀摆放在涂有菌悬液的培养基上，每个培养皿中均匀摆放3 个纸片，分别为黄连乙醇提取液、三黄泻心汤组方水提取液、三黄泻心汤组方乙醇提取液，重复3 次，置于恒温培养箱中培养。

1.7 测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)

取1 g/ml 药液2.0 ml 加入灭菌液体培养基2.0 ml 中，药液质量浓度为0.5 g/ml，采用二倍体度稀释法分别稀释为0.250、0.125、0.625、0.313、0.157、0.078 g/ml。设空白对照(培养基)和生长对照(菌液、培养基)。加入0.1 ml 菌混悬液，培养24 h，无菌生长的最低质量浓度即为MIC。采用十字交叉法测量抑菌直径，记录结果，直径＜8 mm 者不进行统计。

1.8 测定三黄泻心汤组方乙醇提取液稳定性

三黄泻心汤组方乙醇提取液经365 nm 紫外光30、60、90、120 min 照射及60、80、100、120 ℃加热处理，抑菌活性制定方法与“1.6”项相同。

1.9 统计学方法

所有数据均采用SPSS 16.0 软件进行统计学处理，采用Duncan 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑菌活性结果及MIC 值

三黄泻心汤组方水和乙醇提取物的抑菌活性均高于黄连药材乙醇提取物，差异均有统计学意义(P＜0.05);三黄泻心汤组方乙醇提取物的抑菌活性强于水提取物，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。三黄泻心汤组方水提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MIC 值分别为0.313、0.625，三黄泻心汤组方乙醇提取物的MIC 值均为0.313。

表1 三黄泻心汤组方水和乙醇提取物及黄连药材乙醇提取物的抑菌效应(mm，¯x±s)Tab 1 Antibacterial activity of different extracts of Sanhuang Xiexin decoction and Coptis chinensis (mm，¯x±s)

2.2 三黄泻心汤组方乙醇提取物紫外光照射稳定性测定结果

三黄泻心汤组方乙醇提取物经紫外光不同时间照射后与未照射处理对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有稳定的抑制作用，见表2。

表2 不同时间紫外光照处理的三黄泻心汤组方乙醇提取物抑菌效应(mm，¯x±s)Tab 2 Effect of ultraviolet exposure time on antibacterial activities of ethanol extracts of Sanhuang Xiexin decoction (mm，¯x±s)

2.3 三黄泻心汤组方醇提取物温度稳定性测定结果

三黄泻心汤组方醇提取物经不同温度处理后与未加热处理对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有稳定的抑制作用，见表3。

3 讨论

3.1 提取溶媒

传统汤剂以水为提取溶媒进行煎煮，随着现代生产工艺技术的不断改进，出现了多种提取手段及多种溶媒用于中药提取，水、乙醇是最常用的提取溶媒［2-3］。三黄泻心汤由大黄、黄连、黄芩3 味中药组成，其水提取物具有清热泻火解毒、化瘀凉血止血之功效，其乙醇提取物的生物活性尚未见报道。有研究表明，黄连、黄芩和大黄80%乙醇提取物对大肠埃希菌的抑菌活性分别强于各自的水提取物，而黄连、黄柏和黄芩配伍后的80%乙醇提取物对大肠埃希菌的抑菌活性也强于其水提取物［4］。含有黄连的方剂，其乙醇提取物的抑菌活性强于水提取物［5-7］。本研究结果显示，三黄泻心汤75%乙醇提取物对目标菌的抑制活性强于水提取物。

表3 不同温度处理的三黄泻心汤组方乙醇提取物抑菌效应(¯x±s)Tab 3 Effect of temperature on antibacterial activities of ethanol extracts of Sanhuang Xiexin decoction (¯x±s)

3.2 药理作用

黄连与大黄配伍时，小剂量大黄可增强抑制大肠埃希菌的作用，大剂量则抑菌作用消失［8］。在抑制细菌生长的同时，黄连促进大肠埃希菌内毒素释放，大黄却能减少其释放［9］。黄连还有抑制细菌呼吸和核酸合成的作用［10］。黄芩素对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，其抑菌作用是通过影响细胞膜通透性、抑制菌体内蛋白质合成、抑制细菌代谢和DNA 拓扑异构酶等多靶点实现的［11］。本研究结果显示，三黄泻心汤的2 种溶媒提取物的抑菌活性均高于黄连乙醇提取物，提示黄芩、大黄与黄连在对目标菌的抑制方面具有协同作用。常金花［12］研究了三黄分散片在正常、发热和发炎模型大鼠体内的药动学，结果表明，黄芩苷可能与大鼠足跖肿胀度下降有关，芦荟大黄素可能与发热大鼠体温下降有关，大黄酸可能会引起大鼠体温升高。黄连-黄芩和黄连-大黄配伍的乙醇提取物抑菌活性却低于黄连乙醇提取物，提示黄芩、大黄对黄连的抑菌有一定的拮抗作用。本研究中，三黄泻心汤水和乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有抑菌活性，但其乙醇提取物抑菌活性强于水提取物，可用于进一步的医药研发。中药不同配伍及不同提取方式可增加抗菌效果，也能有效减缓抗药性的发生，药材的不同炮制方式对提取工艺也有影响，在三黄泻心汤方剂中采用何种炮制方式能达到最佳抑菌效果应进行进一步研究。

3.3 本研究应用前景

以三黄泻心汤为处方的制剂，包括三黄泻心汤、三黄片、一清颗粒、胶囊等，制备工艺均以水作为提取溶媒。本研究结果显示，三黄泻心汤75%乙醇提取物具有很好的抑菌效果，且对温度和紫外光照射稳定。在现代成分、药理研究基础上，设计更科学、合理的制备工艺、适用剂型、给药途径，制定科学、严格、可控的质量标准，保证药品的质量稳定性，可为三黄泻心汤的再次开发提供依据。

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