响应面优化超声-微波协同提取石榴叶中总黄酮工艺的研究

滕井通， 詹小龙， 宫 坤， 薛建平， 段永波， 宋迎春， 盛 玮*

（1.淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000；2.资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000；3.淮北普豪生物科技有限公司，安徽 濉溪234100）

响应面优化超声-微波协同提取石榴叶中总黄酮工艺的研究

滕井通1，2， 詹小龙1， 宫 坤3， 薛建平1，2， 段永波1，2， 宋迎春1， 盛 玮*1，2

（1.淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000；2.资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 235000；3.淮北普豪生物科技有限公司，安徽 濉溪234100）

为确定石榴叶中总黄酮提取的最佳工艺，在单因素试验的基础上，应用响应面法优化石榴叶中总黄酮的提取条件。结果表明：微波功率、提取时间和料液比对黄酮提取率影响极显著；最佳工艺为：乙醇体积分数71.5%（v/v），微波功率662 W，提取时间262 s，液料质量体积比33.5 g/mL，在此条件下提取1次，石榴叶中总黄酮的提取率为89.21%。

超声-微波协同萃取；石榴叶；总黄酮；响应面法

石榴叶是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的叶，我国石榴以产果为主，重点产区有安徽怀远、淮北，陕西临潼，山东枣庄，云南巧家，四川会理和新疆和田等地区。《图纪本草》记载：“榴叶者，主咽喉燥渴、止下利漏精、止血之功能”。据报道，已从石榴叶中分离出熊果酸、白桦脂酸、甘露醇、菟单宁以及鞣花单宁、没食子酸、鞣花酸、短叶苏木酚、木犀草素4′-O-β-葡萄糖苷、黄酮苷类等20多种化合物[1-3]。其黄酮类物质的含量较高[4-5]，而天然植物黄酮类化合物具有降脂、抗心血管疾病、消除自由基及抗氧化、抗骨质疏松、防癌抗癌等作用[6-8]，可广泛用于医药[9]、化妆品[10]、食品[11]等行业，具有极广的应用开发前景。

超声-微波协同萃取，具有操作简单、能有效提高提取率、缩短提取时间、降低能耗，节约成本等优点，在蛋白质、色素、多糖、油脂、叶绿素等提取方面应用广泛[12-18]。作者以石榴叶为原料，采用超声-微波协同萃取石榴叶中总黄酮，通过响应面法优化石榴叶中总黄酮提取工艺，为开发利用石榴叶黄酮提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴叶：十月下旬采收于淮北塔山，干燥、粉碎后过20目筛备用。

体积分数95%乙醇、浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等：均为国产分析纯；芦丁标准品：（纯度＞98%），中国药品生物制品检定所提供。

1.2 仪器与设备

CW-2000超声-微波协同萃取仪：上海新拓微波溶样测试技术有限公司产品；UV–4802型紫外可见分光光度计：尤尼科上海仪器有限公司产品；JA2003电子天平：上海良平仪器仪表有限公司产品；FDV超微粉碎机：北京环亚天元机械技术有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 黄酮类化合物含量测定 芦丁标准溶液的配制及标准曲线的制定是在参考相关文献[19]的基础上适当修改，其方法为：准确称取芦丁标准品10.00 mg，用体积分数75%的乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，其质量浓度为 0.200 mg/mL的标准溶液。准确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL标准溶液于10 mL的容量瓶中，再分别加入0.3 mL质量分数5%NaNO2溶液，摇匀后放6 min，加入0.3 mL质量分数10%Al（NO3）3溶液，摇匀后放置 6 min，加入4.0 mL质量分数4%NaOH溶液，最后用体积分数75%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12 min后，在最大吸收峰508 nm处测定各浓度标准品的吸光度，以吸光度对质量浓度做标准曲线，所得线性回归方程为A=11.201C－0.013 1，R2=0.999 8。

石榴叶中总黄酮的测定：取石榴叶提取液1.0 mL于10 mL的容量瓶中，分别加入质量分数5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入质量分数10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀后放置 6 min，再加入质量分数4%NaOH溶液4.0 mL，最后用体积分数75%的乙醇定容至刻度，摇匀后静置12 min，在508 nm处测定吸光度，根据线性回归方程换算成样品中的总黄酮含量。

1.3.2 石榴叶中总黄酮提取单因素研究 准确称取一定量的石榴叶粉，按一定比例加浸提剂，在一定的条件下进行超声-微波辅助浸提后，将提取液过滤定容，测定总黄酮的含量。根据提取液总黄酮的含量研究乙醇体积分数、微波功率、提取时间、液料比等因素对石榴叶中总黄酮的提取效果的影响。

问题(8)即为文献[12]中提出的半正定规划问题,文献[12]已经理论证明了该问题中最优解Y的秩最高为2,而近似WLS问题的最优解的秩应为1。显然,由于松弛的影响,半正定规划的解并不一定是近似WLS问题的最优解。若要得到秩为1的解,一种自然的想法是通过加入其他有效约束来收紧该问题。观察约束‖x-s0‖=r0(即y(2k+1)=‖y(1:k)-s0‖),其经过松弛可变为‖x-s0‖≤r0,它涉及到优化变量y之间的内在联系。一个自然的问题是,若在现有半正定规划问题中加入此约束,能否起到收紧约束集的作用?下面的命题回答了这个问题。

1.3.3 石榴叶中总黄酮提取率的计算

式中，c为每级提取液黄酮的质量浓度（mg/mL）；V为每级提取液的体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 不同乙醇体积分数的浸提剂对石榴叶中总黄酮提取效果的影响

称取10.0 g石榴叶粉，按液料体积质量比30 mL/g加入不同体积分数乙醇溶液，在微波功率600 W下萃取240 s。由图1可知，乙醇体积分数在50%～70%范围内，随着乙醇体积分数增加，石榴叶中总黄酮提取率增加，但乙醇体积分数超过70%时，石榴叶中总黄酮提取率反而下降，故提取剂的乙醇体积分数以70%左右为宜。

2.2 微波功率对石榴叶中总黄酮提取效果的影响

称取10.0 g石榴叶粉，按液料体积质量比30mL/g加入体积分数70%的乙醇溶液，分别在150、300、450、600、750、900 W的微波功率下萃取240 s。由图2可知，当微波功率在150～600 W时，随着微波功率的增大，微波的作用逐渐加强，石榴叶中总黄酮得率逐渐增加。当微波功率达到600 W时，提取率达到最大，之后呈逐渐下降趋势，可能是由于较大微波功率使石榴叶中的某些黄酮类成分遭到破坏，从而导致黄酮得率有所下降[20]，因此微波功率以600 W左右为宜。

图1 乙醇体积分数对石榴叶中总黄酮提取效果的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction

图2 微波功率对石榴叶中总黄酮提取效果的影响Fig.2 Effects of microwave output power on extraction

图3 浸提时间对石榴叶中总黄酮提取效果的影响Fig.3 Effects of extraction time on extraction

图4 液料体积质量比对石榴叶中总黄酮的浸提效果Fig.4 Effects of different ratio of material to solvent on extraction

2.3 浸提时间对石榴叶中总黄酮提取效果的影响

称取10.0 g石榴叶粉，按液料体积质量比30 mL/g加入体积分数70%的乙醇溶液，在微波功率600 W下分别萃取60、120、180、240、300、360、420 s，其结果如图3。由图3可知，在240 s时间内，随时间的延长，石榴叶中总黄酮提取率迅速增加。超过240 s后，石榴叶中总黄酮不再增加，反而出现下降，这可能是由于石榴叶中的某些黄酮类成分降解及提取剂挥发所致。从生产成本考虑，提取时间越长，能耗越大，故提取时间以240 s左右为宜。

2.4 液料体积质量比对石榴叶中总黄酮提取效果的影响

称取10.0 g石榴叶粉，按不同液料体积质量比比分别加入体积分数70%的乙醇溶液，在微波功率600 W下萃取240 s。由图4可知，石榴叶中总黄酮提取率随液料体积质量比的增加显著提高，其原因可能是随着液料体积质量比的增加，黄酮的传质动力也增加，使得原料中更多的黄酮融入提取剂中。当液料体积质量比超过30 mL/g时，黄酮的提取率没有显著变化，综合考虑浸提效果、溶剂用量和浓缩负荷3方面，选择液料体积质量比为30 mL/g左右为宜。

2.5 超声-微波协同提取石榴叶中总黄酮的工艺优化

2.5.1 试验设计与结果 以单因素实验结果为基础，根据Box-Behnken实验设计原理，选取乙醇体积分数（X1）、微波功率（X2）、提取时间（X3）和液料体积质量比（X4）4个因素为自变量，以石榴叶总黄酮提取率为响应值，每一个自变量的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码（表1），根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、二次项、交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值，试验方案及结果见表2。

表1 Box-Benhnken响应面分析试验因素与水平Table1 Factorsand levelsin theBox-Benhnken experimental design

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

由表3可以看出，回归方程具有高度的显著性（P≤0.01），失拟项具有不显著性（P=0.07＞0.05），R2= 99.33%，表明响应值石榴叶总黄酮提取率实际值与（X1-70）/10，x2=（X2-600）/150，x3=（X3-240）/60，x4=（X4-30）/5。

2.5.2 模型方程的建立与显著性检验 通过Minitab 15统计软件分析，获得石榴叶总黄酮提取率对编码自变量乙醇体积分数、微波功率、提取时间和液料比的二次多项回归。根据实验结果建立的数学模型为：A=88.39-0.075 8x1+2.868 3x2+1.273 3x3+ 3.346 7x4-4.296 73x12-3.082 9x22-1.780 4x32-2.419 2x42+2.705x1x2+1.587 5x1x3-0.09x1x4-0.907 5x2x3-0.192 5x2x4+0.245x3x4。预测值之间具有较好的拟合度。为检验方程的有效性，对石榴叶中总黄酮提取的数学模型进行显著性检验。由表4可知，一次项X2、X3和X4极显著（P≤0.01），说明微波功率、提取时间和液料体积质量比对石榴叶中总黄酮提取率有极显著影响。交互项X1X2、X1X3、X2X3极显著（P≤0.01），说明乙醇体积分数和微波功率、乙醇体积分数和提取时间、微波功率和提取时间交互项对石榴叶中总黄酮提取率有极显著的影响。二次项X12、X22、X32和X42对石榴叶中总黄酮提取率也有极显著的影响（P≤0.01）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表4 回归方程偏回归系数的估计值Table 4 Estimated valuesofthe partialregression coefficients of the regression model

2.5.3 响应面分析 响应面图形是响应值对应于试验因素X1、X2、X3和X4所构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高线图，可以直观地反映各因素及他们之间的交互作用对响应值的影响。实验结果显示，乙醇体积分数，液料体积质量比，微波功率对总黄酮提取率的影响较显著。另外，乙醇体积分数与微波功率、乙醇体积分数与提取时间、乙醇体积分数与液料体积质量比及微波功率与提取时间的交互作用较强，对总黄酮提取率影响显著。

2.5.4 石榴叶中总黄酮最佳提取条件的确定和实验验证 在选取的各因素范围内，根据回归模型通过Minitab 15软件分析得出，石榴叶中总黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数为71.515%，微波功率为662.121 W、超声-微波协同萃取时间为262.424 s、液料体积质量比33.485 mL/g，石榴叶中总黄酮提取率的预测值为90.38%。考虑到实际操作的便利，确定石榴叶中总黄酮的超声-微波协同波提取工艺条件为超声-微波协同提取时间262 s、微波功率662 W、乙醇体积分数为71.5%、液料体积质量比33.5 mL/g。为了证实预测的结果，用试验中得到的最佳提取工艺条件重复实验3次，石榴叶中总黄酮平均提取率为（89.21±2.67）%，与预测值90.38%基本一致（相对误差1.31%），说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应曲面法适用于对石榴叶中总黄酮的超声-微波协同提取工艺进行回归分析和参数优化。

2.6 浸提次数对石榴叶中总黄酮提取效果的影响

准确称取石榴叶粉，每次按液料体积质量比33.5 mL/g加入71.5%乙醇溶液为浸提剂，微波功率为662 W，超声-微波协同萃取时间为262 s。由表5可知，第1次的提取率高达89.21%，第2次的提取率7.32%，2次总的提取率达到96.53%。考虑到溶剂成本及浓缩过程能量的消耗，石榴叶中总黄酮浸提次数以1次为宜。

3 结语

在单因素试验基础上，利用试验设计软件Minitab 15，采用响应面法建立了石榴叶中总黄酮提取工艺条件的二次多项式数学模型，对各因子对响应值的影响进行了分析。结果表明模型拟合程度高，试验误差较小。优化得到的石榴叶中总黄酮提取工艺条件为超声-微波协同萃取时间为262 s、微波功率为662 W、乙醇体积分数为71.5%、液料体积质量比为33.5 mL/g。在此工艺条件下，对石榴叶提取1次，黄酮提取率为89.21%。

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Optimization of Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction of Total Flavonoids from Leaves of Punica granatum L. by Response Surface Methodology

TENG Jingtong1，2， ZHAN Xiaolong1， GONG Kun3， XUE Jianping1，2，DUAN Yongbo1，2， SONG Yingchun1， SHENG Wei*1，2
（1.College of Life Sciences，Huaibei Normal University，Huaibei 235000，China；2.Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology，Huaibei 235000，China；3.Huaibei Puhao Biological Technology Co.，Ltd.，Suixi 234100，China）

To optimize the extraction technology of total flavonoids from Leaves of Punica granatum L.，response surface methodology was applied on the basis of single factor tests.The results showed that microwave power，extraction time and liquid-to-material ratio had extremely significant effect on the extraction rate of total flavonoids.Ethanol concentration of 71.5%（v/v），microwave power of 662 W，extraction time of 242 s and solid/liquid ratio of 33.5（g/mL）were found optimum.Under the optimized conditions，the extraction rate of total flavonoids from Leaves of Punica granatum L.was 89.21%by extracting once.

ultrasonic-microwave synergistic extraction，leaves of Punica granatum L.，total flavonoids，response surface methodology

TS 225.4

A

1673—1689（2015）07—0744—07

2014-07-21

安徽省科技计划项目（12070303032）；安徽省教育厅自然基金项目（KJ2012A255）。

滕井通（1975—），男，蒙古族，江苏徐州人，理学硕士，讲师，主要从事食品及保健品研究。E-mail：tt7510@163.com

*通信作者：盛玮（1963—），男，河南信阳人，理学硕士，教授，主要从事食品生物技术研究。E-mail：biosw2006@126.com