孕期和哺乳期大鼠肝脏胆酸和胆酸调控法尼醇X受体、小异二聚体伴侣受体和胆固醇7α-羟化酶的变化*

谢红梅,朱琼妮,张 丹,刘 杰,陆远富 △

(1.遵义医学院第三附属医院妇产科，遵义 563003；2.遵义医学院药理教研室暨贵州省基础药理重点实验室，遵义 563003；3.美国堪萨斯大学医学中心，美国堪萨斯洲 60016)

论著·基础研究

孕期和哺乳期大鼠肝脏胆酸和胆酸调控法尼醇X受体、小异二聚体伴侣受体和胆固醇7α-羟化酶的变化*

谢红梅1,朱琼妮2,张 丹2,刘 杰3,陆远富2△

(1.遵义医学院第三附属医院妇产科，遵义 563003；2.遵义医学院药理教研室暨贵州省基础药理重点实验室，遵义 563003；3.美国堪萨斯大学医学中心，美国堪萨斯洲 60016)

目的研究健康SD鼠在妊娠和哺乳期肝脏胆酸代谢基因的变化。方法取孕10、14、19 d及产后1、7、14、21 d的大鼠肝脏，检测胆酸水平和肝脏法尼醇X受体(FXR)、小异二聚体伴侣受体(SHP)、胆固醇7α-羟化酶(Cyp7α1)的表达。用Western blot法测Cyp7α1的蛋白表达情况。结果孕晚期健康大鼠，肝脏中胆酸及Cyp7α1表达不升高；哺乳期的大鼠，肝脏胆酸增加，FXR表达升高；在孕晚期及哺乳期靶基因SHP表达均高于对照组，且其表达高峰期是第孕19天，其值可达对照组的6倍之多。结论健康大鼠在产后肝脏胆酸合成增加，而孕期减少，可能与Cyp7α1、FXR及SHP表达有关。

孕鼠；哺乳鼠；肝脏胆酸；法尼醇X受体；小异二聚体伴侣受体；胆固醇7α-羟化酶

妊娠晚期的肝内胆汁淤积症(ICP)发病率为0.8%～12.0%；少数发生在妊娠中期，以皮肤瘙痒和肝胆汁酸浓度增高为特征，表现为胆酸代谢紊乱。主要危及胎儿安全。目前病因尚不清楚，可能与雌激素、遗传及环境等因素有关[1]。在我国及国外大量实验研究提示，ICP的发病机制与肝脏胆酸代谢紊乱有密切相关性[2]。则参与胆酸合成代谢的相关分子都可能是ICP的起病原因，基于动物的ICP模型。但在正常孕哺大鼠的肝内胆酸代谢少有报道。故笔者选用SD大鼠，观察孕期和哺乳期胆酸及相关调控胆酸代谢基因的变化，进一步探讨正常孕哺大鼠胆酸合成及其调控，为ICP的基础研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选SD雌性大鼠，体质量250～300 g，在合格动物房(许可证号:SYXK2011-004)适应性喂养1周后，雌雄定期配种至配种成功。取孕10、14、19 d及产后1、7、14、21 d的大鼠肝脏进行试验。所有实验动物均获遵义医学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器 美国BIO-RAD公司RT-PCR扩增仪，美国Thermo公司酶标仪，紫外分光光度计，德国Eppendorf公司多功能梯度PCR仪，贝克曼系列DXC800生化分析仪。试剂:Trizol(TakaRa公司，批号:BK3502)，上海华舜生物技术有限公司RNA纯化试剂盒，高通量RT试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,批号:0912197)。Cyp7α1兔抗大鼠单克隆抗体(Abcam，编号A0208)，过氧辣根酶标记羊抗兔二抗(碧云天，编号ab65596)。

1.2.2 标本采集与处理 于孕鼠第10、14、19 d及产后1、7、14、21 d用7%水合氯醛麻醉后收集肝脏，放入-80 ℃保存。

表1 PCR引物序列

1.2.3 RNA提取及RT-PCR 将肝组织标本按RNA提取步骤(匀浆、萃取、离心、分层、沉淀、洗涤、空干、溶解等)处理后，测其浓度和纯度(260/280 nm)，反转录为cDNA ，用实时定量PCR测定相应基因的表达，以β-actin及G3PDH为内参基因。

1.2.4 肝胆酸测定 取50～100 mg肝组织，匀浆，离心(12 000 g/min,10 min,4 ℃),用上清液在贝克曼系列生化分析仪DXC800(波长405 nm和660 nm)测胆酸含量。

1.2.5 Western blot半定量分析肝组织Cyp7α1 用蛋白提取混合液匀浆提取，BCA法测蛋白浓度。采用常规十二烷基-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)法，转膜，用Abcam公司的Cyp7α1抗体测其表达。

2 结 果

2.1 肝脏胆酸 在妊娠10 d和19 d时下降，在哺乳期上升，产后21 d最高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

*:P<0.05，与对照组比较；GD10:孕10 d；GD14:孕14 d；GD19:孕19 d；PND:产1 d；PND7:产7 d；PND14:产14 d；PND21:产21 d。

图1 大鼠肝脏中的胆汁酸变化

*:P<0.05，与对照组比较；GD10:孕10 d；GD14:孕14 d；GD19:孕19 d；PND:产1 d；PND7:产7 d；PND14:产14 d；PND21:产21 d。

图2 SHP、FXR在大鼠肝脏中的表达

2.2 孕鼠及哺乳期大鼠肝组织中SHP、FXR表达变化 在孕期SHP升高，孕晚期进一步升高，孕19 d升高6倍，哺乳期略下降；孕期FXR无明显变化，但哺乳期升高，产后14 d升至最高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 肝脏Cyp7α1的表达 大鼠肝脏组织中Cyp7α1 mRNA 在孕晚期下降，但在哺乳期增加。差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.4 Cyp7α1 蛋白质在大鼠肝脏中的表达 Cyp7α1在哺乳期增加，但在孕晚期无明显变化，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

*:P<0.05，与对照组比较；GD10:孕10 d；GD14:孕14 d；GD19:孕19 d；PND:产1 d；PND7:产7 d；PND14:产14 d；PND21:产21 d。

图3 Cyp7α1在大鼠肝脏中的表达

*:P<0.05，与对照组比较；GD10:孕10 d；GD14:孕14 d；GD19:孕19 d；PND:产1 d；PND7:产7 d；PND14:产14 d；PND21:产21 d。

图4 Cyp7α1 蛋白在大鼠肝脏中的表达

3 讨 论

随着医学的发展，由于ICP患者围生儿发病率及病死率较高，ICP逐年引起围生医学界的重视。ICP病因尚不清楚。研究表明，ICP的发生可能与胆汁酸代谢紊乱相关[2]。胆酸可引起母体肝细胞损伤、绒毛毛细血管痉挛收缩，以及胆盐沉积胎盘等引起胎儿营养不良，导致胎儿羊水粪染、宫内窘迫、早产、死胎、死产，最严重者可发生不可预测胎儿宫内死亡，因此，母体胆酸水平的异常增高与围生儿的预后相关[3]。但正常孕期胆酸及相关调控基因的研究目前鲜有报道。本实验表明:健康大鼠肝脏胆酸合成在孕期减少，产后增加且与肝脏Cyp7α1及核受体FXR、SHP表达相关[6]。胆汁酸的体内平衡主要是一些反馈和负反馈机制自动调节，调节过程有多种核受体参与，其中FXR是参与调控节主要核受体，调控胆汁酸代谢过程中的关键酶和转运体，其靶基因包括Cyp7α1等[11]。FXR主要通过下面2条途径调节胆汁形成:(1)FXR可以参与调节Bsep、Mdr3来间接调控胆汁酸的合成及分泌。(2)通过上调其他SHP，来降低Cyp7α1的活性，从而使胆汁酸的合成降低[12]。病理情况下，肝内胆酸瘀积激活FXR，阻遏Cyp7α1的转录从而使胆汁酸生成减少[14]。在本研究中，哺乳期胆酸、FXR及Cyp7α1均升高，推测FXR对Cyp7α1的调节生理状况改变而异，但具体机制需进一步研究。SHP主要在肝脏表达的一种特殊核受体，抑制Cyp7α1的表达，同时可以与肝脏因子4α结合，抑制Cyp8β1和Cyp27α1的转录，导致胆汁酸合成减少。SHP与肝受体同源物(LRH)结合后，抑制LRH转录，激活Cyp7α1基因的功能[13]。本研究中，孕晚期胆酸降低，FXR表达水平降低，而SHP增加6倍，与文献中一致。妊娠期SHP提高，降低胆酸合成的酶量，从而使胆酸的合成量减少，胆酸对胎儿的毒性也减少。还有研究表明，产后哺乳期大鼠中Cyp7α1的表达及肝胆汁酸均增加2～3倍[9]。本实验表明，大鼠妊娠晚期肝内胆汁酸不变，哺乳期升高，与文献报道一致。另有文献报道:肝胆汁酸水平与Cyp7α1的表达量呈正相关[14]。孕期雌孕激素可降低Cyp7α1的活性从而抑制胆汁酸的合成，减少其对胎儿的毒性作用，利于胎儿的生长发育[3]，而哺乳期雌孕激素水平下降，使Cyp7α1的活性增加，从而使胆汁酸的合成增加。本研究也提示，肝胆汁酸水平与Cyp7α1的表达呈正相关。

综上所述，大鼠孕晚期肝胆酸下降，哺乳期升高，可能与妊娠期SHP的表达升高及产后胆酸合成酶Cyp7α1及FXR、SHP基因高表达相关。

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统计资料类型

统计资料共有三种类型:计量资料、计数资料和等级资料。按变量值性质可将统计资料分为定量资料和定性资料。

定量资料又称计量资料，指通过度量衡的方法，测量每一个观察单位的某项研究指标的量的大小，得到的一系列数据资料，其特点为具有度量衡单位、多为连续性资料、可通过测量得到，如身高、红细胞计数、某一物质在人体内的浓度等有一定单位的资料。

定性资料分为计数资料和等级资料。计数资料为将全体观测单位(受试对象)按某种性质或特征分组，然后分别清点各组观察单位(受试对象)的个数，其特点是没有度量衡单位，多为间断性资料，如某研究根据患者性别将受试对象分为男性组和女性组，男性组有72例，女性组有70例，即为计数资料。等级资料是介于计量资料和计数资料之间的一种资料，可通过半定量的方法测量，其特点是每一个观察单位(受试对象)没有确切值，各组之间仅有性质上的差别或程度上的不同，如根据某种药物的治疗效果，将患者分为治愈、好转、无效或死亡。

Hepatic bile acids and the expression of FXR,SHP,and Cyp7α1 in normal rats during pregnancy and lactation*

XieHongmei1,ZhuQiongni2,ZhangDan2,LiuJie3,LuYuanfu2△

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.TeachingandResearchSectiorofPharmacology/KeyLabofBasicPharmacologyofGuizhou,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;3.UniversityofKansasMedicalCenter,Kansas,KS60016,USA)

Objective To investigate the accumulation of liver bile acids and bile acid regulated nuclear receptor farnesoid X (FXR) and its target gene cholesterol 7α hydroxylase (Cyp7α1) and small different dimer partner (SHP) in normal rats during pregnancy and lactation.MethodsSD rats were maintained in the SPF-grade facilities for time-controlled mate.Livers were collected at Gestation Day (GD) 10,14,and 19 and Postnatal Day (PND) 1,7,14 and 21 d.Hepatic bile acids were quantified with a total bile acid assay kit,and mRNA expression of FXR,Cyp7α1 and SHP was determined by RT-PCR.Western blot was used for Cyp7α1 protein quantification.ResultsIn livers of normal rats,bile acids was not elevated during pregnancy but was increased during lactation.The bile acid synthesis rate limiting enzyme Cyp7α1 increased during lactation but were normal during pregnancy.SHP was 6 fold higher at the late pregnancy,and slightly higher during lactation.FXR was increased at postpartum.ConclusionUnder normal circumstances,hepatic bile acid synthesis during pregnancy was controlled by SHP feedback,while during lactation,hepatic bile acids increased,along with increased Cyp7α1 and FXR.

pregeant rats;postnatal rats;liver bile acids;nuclear receptor farnesoid X;small different dimer partner;cholesterol 7α hydroxylase

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.004

贵州省科技厅国际合作项目[黔科合外G字(2009)70019]；贵州省教育厅研究生教育创新基地项目(023)。

:谢红梅(1973-)，硕士，副主任医师，主要从事代谢与毒理工作。△

，Tel:13368527800；E-mail:yflu@zmc.edu.cn。

R714.1

A

1671-8348(2015)30-4187-03

2015-03-08

2015-05-27)