丙戊酸钠联合全反式维甲酸促进子宫颈癌细胞衰老的发生

尤青叶，冯定庆，凌 斌，3，张红丽，李 兵，伍娇娇，赵婷婷

丙戊酸钠联合全反式维甲酸促进子宫颈癌细胞衰老的发生

尤青叶1，冯定庆2，凌 斌1，3，张红丽1，李 兵1，伍娇娇1，赵婷婷1

目的研究丙戊酸钠（VPA）联合全反式维甲酸（ATRA）诱导子宫颈癌细胞衰老作用，并探讨其分子机制。方法实验分为对照组、VPA组、ATRA组、VPA＋ATRA组，采用3 mmol／L VPA、1 μmol／L ATRA单独或联合作用于人子宫颈癌HeLa及SiHa细胞，对照组仅加溶媒；采用CellTiter 96®AQueous法检测细胞增殖；β-半乳糖苷酶化学染色法检测细胞衰老；Q-PCR和Western blot法分别检测衰老相关基因P16、P63、hTERT的mRNA和蛋白表达变化。结果VPA对HeLa及SiHa细胞均有生长抑制作用，与ATRA联合抑制效果明显优于单独用药（P＜0.05）；β-半乳糖苷酶染色显示，VPA＋ATRA组衰老细胞比例显著增加，与对照组及VPA组、ATRA组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；QPCR和Western blot法结果显示，VPA单独和联合ATRA可上调P16、P63的表达，降低hTERT的表达，且联合用药优于单独用药及对照组（P＜0.05）。结论 VPA联合ATRA可抑制子宫颈癌细胞增殖，上调P16和P63的表达，下调hTERT的表达，可能是其诱导细胞衰老的分子机制。

子宫颈癌；丙戊酸；维甲酸；细胞衰老

近年来子宫颈癌的发病率有明显上升和年轻化趋势，发病率以每年2%～3%的速度增长［1］。早期子宫颈癌患者可采用手术治疗，而晚期患者主要以铂类化疗为主，但毒副作用大，患者易对其产生耐药性，患者生存率大大降低［2－3］。丙戊酸钠（valproate acid，VPA）是一种传统的抗癫痫药物，同时也是一种组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂，高效、安全、低毒、可口服的特点使其极具临床前景。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是维生素A的生物活性代谢产物，与其受体结合，具有促进上皮细胞分化成熟的作用，已作为一种诱导分化剂用于临床肿瘤的治疗。研究［4-5］证实VPA联合ATRA可使子宫颈癌细胞发生细胞周期阻滞，并诱导细胞分化，但细胞凋亡增加不明显。该研究进一步分析VPA联合ATRA的抗子宫颈癌作用，观察其对细胞衰老的影响并探讨其可能的分子机制，为寻求新的子宫颈癌治疗方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂VPA购自杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司，用PBS稀释成600 mmol／L的储存液，－20℃保存；ATRA购自美国Sigma公司，用DMSO稀释成833 mmol／L的储存液，－20℃保存；CellTiter 96®AQueous购自美国Promega公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；P16、P63、hTERT抗体购自英国Abcam公司；相应蛋白的辣根酶标记二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DMEM培养基购自美国GIBCO公司；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；ECL-增强化学发光检测试剂购自瑞士罗氏公司；BIORAD化学发光仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 细胞培养及分组人子宫颈癌细胞株HeLa与SiHa购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。细胞培养于含有10%小牛血清、100 U／ml青霉素和100 U／ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2孵箱孵育，48 h换液1次，取对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、VPA组、ATRA组、VPA＋ATRA组。各组药物终浓度为VPA 3 mmol／L、ATRA 1 μmol／L。观察48 h。

1.3 CellTiter 96®AQueous法检测细胞增殖取对数生长期的HeLa及SiHa细胞经胰酶消化制成细胞悬液，以1 500个／孔的密度接种于96孔板，37℃、5%CO2培养24 h后，各用药组分别加入相应的药物，对照组仅加溶媒，每组设3个复孔。分别于24、48、72、96 h加CellTiter 96®AQueous工作液，1 h后酶标仪490 nm波长处检测各孔吸光度（optical density，OD）值。生长抑制率（%）＝（用药组OD值－对照组OD值）／对照组OD值×100%。实验重复3次。

1.4 β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老取对数生长期细胞，制成单细胞混悬液，以1×106个／ml的密度接种于6孔板，37℃、5%CO2培养24 h后，各用药组分别加入相应的药物，对照组用溶媒处理。孵育48 h后吸除培养液，PBS洗涤2次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min后吸除固定液，PBS洗涤3次，加入1 ml染色工作液，37℃孵育过夜，第2天取出用PBS洗涤，再加1次PBS保留，显微镜下观察并拍照。衰老指数（%）＝（阳性细胞数／总细胞数）×100%。

1.5 Q-PCR法检测P16、P63、hTERT mRNA的表达收集细胞加入TRIzol，提取总RNA，按照Prime-Script®RT操作说明配制逆转录反应体系，逆转录合成cDNA。P16、P63、hTERT引物序列及扩增产物大小见表1（PCR引物序列检测的P63为TAP63亚型）。按照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明设置反应体系及参数，进行荧光定量PCR的检测，按照2－ΔCt即2－（目的基因Ct－管家基因Ct）计算各基因的相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。

1.6 Western blot法检测子宫颈癌细胞株中P16、P63、hTERT的表达收集细胞加入RIPA裂解细胞，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。分别配制6%和8%的SDS-PAGE电泳凝胶，恒压电泳分离；半干法恒压15 V转膜30 min；4℃摇床上封闭过夜。加入一抗P16（1∶1 000）、P63（1∶500）、hTERT（1∶1 000）和内参照GAPDH抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜；分别加入相应的二抗（1∶1 000），室温孵育2 h，ECL-增强化学发光检测试剂显色，BIORAD化学发光仪进行检测。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以±s表示。组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 VPA联合ATRA抑制子宫颈癌细胞增殖CellTiter 96®AQueous法检测结果显示VPA和ATRA对HeLa、SiHa细胞均有增殖抑制作用，两药联合则具有协同／相加的作用，与VPA组、ATRA组及对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 VPA联合ATRA促进HeLa、SiHa细胞衰老β-半乳糖苷酶染色结果显示，对照组HeLa细胞β-半乳糖苷酶阳性率为（5.3±1.61）%，SiHa细胞为（3.6±1.56）%；VPA＋ATRA组衰老指数显著增加，其中HeLa细胞为（27.5±4.46）%，SiHa细胞为（35.33±4.55）%，与其他各组比较差异均有统计学意义（F＝106.7，P＜0.05）。提示VPA联合ATRA能够显著促进子宫颈癌细胞的衰老，见图2。

2.3 衰老相关基因mRNA的表达变化Q-PCR法检测结果显示HeLa、SiHa细胞经药物处理48 h后，与对照组比较，VPA可上调P16、P63的mRNA表达水平（F＝39.51，P＜0.05）；与对照组比较，VPA＋ATRA组SiHa细胞中P16的表达水平上调（P＜0.05），HeLa细胞中P16、P63表达水平和SiHa细胞中P63表达水平显著上调（P＜0.01）；VPA＋ATRA组与VPA组、ATRA组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），但SiHa细胞中P16表达水平VPA＋ATRA组与VPA组、ATRA组比较差异无统计学意义。与对照组比较，HeLa、SiHa细胞中VPA组和VPA＋ATRA组均能降低hTERT mRNA表达水平（P＜0.05）；VPA＋ATRA组强于VPA组、ATRA组（P＜0.01）。见图3。

2.4 P16、P63及hTERT的蛋白表达水平变化与各基因mRNA表达变化一致，HeLa、SiHa细胞经VPA单独和联合ATRA处理后，P16、P63的蛋白表达水平明显升高，而hTERT的蛋白表达水平显著降低，VPA＋ATRA组与对照组及VPA组、ATRA组比较差异均有统计学意义（F＝40.56，P＜0.05），见图4。

3 讨论

在多种肿瘤中存在的结构或表达异常、组蛋白乙酰化水平异常，从而导致了特定抑癌基因的表达抑制。研究［6］显示HDAC抑制剂能够与HDAC特异性结合并抑制其活性，促进组蛋白的乙酰化修饰，上调相关抑癌基因的表达，在多种肿瘤中显示了抗肿瘤作用。HDAC抑制剂可能通过多种途径起到抗肿瘤作用，包括调控多种细胞凋亡途径及凋亡相关蛋白的表达及其稳定性，诱导肿瘤细胞生长停滞、分化或细胞凋亡［7］，也可能抑制肿瘤血管的生成，影响肿瘤细胞的侵袭和转移［8］。除了内在的抗肿瘤活性，HDAC抑制剂还可增加对传统的细胞毒性药物和肿瘤细胞放射的敏感性。研究［4－5］表明，VPA是一种HDAC抑制剂，联合ATRA可通过诱导细胞分化而发挥抗子宫颈癌作用。本研究显示VPA与ATRA联合用药可促进子宫颈癌细胞衰老。

既往研究［9］显示，VPA联合ATRA可调控多种基因表达，包括多种抑癌基因。本研究显示两药联合上调P16和P63的表达。P16是目前已经明确的一种重要的抑癌基因，其主要通过p16-cyclinD／CDK-RB途径对细胞周期进行调控。研究［10］显示细胞发生衰老时，P16表达明显升高，当年轻的细胞中导入P16基因细胞可出现衰老表型，提示P16是细胞寿限的关键调控基因之一。Duan et al［11］以P16正反义载体分别转染年轻的人成纤维细胞，发现P16过表达抑制了RB磷酸化从而引起细胞早衰而其反义载体转染可以延缓细胞衰老。说明P16的积累不是衰老的结果而是衰老的诱因。P63是近几年来新发现的P53蛋白家族成员，其在上皮细胞发育，基因中两个不同的启动子，将其翻译产物分为两种亚型，即反式激活域完整的TAP63和反式激活域N端截短的△NP63。TAP63转录激活（TA）结构域与P53的TA结构域具有同源性，可以激活P53的下游基因，具有与P53相似的抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的作用。Truong et al［12］认为TAP63具有促进肿瘤细胞衰老的作用。目前研究［13］表明，HDAC抑制剂所诱导的细胞衰老部分是由P63介导的，这可能与不同细胞系特性和不同类型HDAC抑制剂作用的差别有关。

肿瘤细胞发生衰老是由很多因素参与在内的。hTERT是人类端粒酶蛋白的催化亚单位，其表达水平与细胞衰老密切相关。本研究显示VPA联合ATRA诱导衰老的子宫颈癌细胞中hTERT表达水平显著降低。hTERT能激活端粒酶，端粒酶是细胞中负责端粒延长的一种酶，其能延长缩短的端粒，当端粒酶合成端粒难以弥补缩短的端粒时，端粒将进行性缩短，从而诱导体内细胞衰老。有研究［14］提示hTERT在肿瘤细胞、干细胞等永生化细胞中的表达水平很高，防止细胞因端粒缩短而发生细胞衰老、凋亡。由此可见，端粒、端粒酶在细胞衰老和肿瘤的发生中具有重要的作用，有可能成为肿瘤诊断的重要指标，同时，也可能成为肿瘤治疗的新靶点。

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Studies on promoting cellular senescence by VPA combined with ATRA in cervical cancer cells

You Qingye1，Feng Dingqing2，Ling Bin1，3，et al（1Dept of Obstetrics and Gynecology，2Key Laboratory of Molecular Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；
3Dept of Obstetrics and Gynecology of China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100086）

ObjectiveTo study valproate acid（VPA）combined with all-trans retinoic acid（ATRA）induced cervical cancer cells senescence，and explore its mechanism.MethodsThe experiment is divided into the control group，the VPA group，ATRA and VPA＋ATRA groups.HeLa and SiHa cells were treated with combinated use of 3 mmol／L VPA，1 μmol／L ATRA or respectively.The control group was treated with vehicle only.Using CellTiter 96®Aqueous cell proliferation assay to detect the inhibitory rate of proliferation.Apply β-galactosidase staining method to observe the senescence.The mRNA expressions of P16，P63 and hTERT were detected using Q-PCR and its protein expressions were determined using Western blot.ResultsThe proliferation of HeLa and SiHa cells were significantly inhibited by VPA.The effect of VPA combinated with ATRA was stronger than individual treatment（P＜0.05）.β-galactosidase staining showed that β-galactosidase staining rate was up-regulated after VPA combined with ATRA in cervical cancer HeLa and SiHa cells，the difference was significant compared with control group and individual group（P＜0.05）.Q-PCR and Western blot showed that VPA enhanced the mRNA and protein expression of P16，P63 and reduced the expression of hTERT.The efficacy was more powerful in combination therapy group（P＜0.05）.ConclusionVPA combined with ATRA can inhibit the growth of cervical cancer cell lines.The effect of inducing cervical cancer cells senescence may be related with up-regulation of P16，P63 and downregulation of hTERT.

cervical cancer；valproic acid；tretinoin；cell senescence

R 737.33

1000－1492（2015）02－0135－05

2014－11－03接收

国家自然科学基金（编号：81372777、81372779、81072127）

安徽医科大学附属省立医院1妇产科、2分子医学重点实验室，合肥 2300013卫生部中日友好医院妇产科，北京 100086

尤青叶，女，硕士研究生；凌 斌，男，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：lingbin.ling＠gmail.com