稳定敲低SIGIRR的人肾小管上皮细胞的构建及其初步功能的研究

蒋克国，王德光，周海胜，查晓军，张桂霞，金福泉，季 爽，潘海峰，叶冬青，郝 丽

◇基础医学研究◇

稳定敲低SIGIRR的人肾小管上皮细胞的构建及其初步功能的研究

蒋克国1，王德光1，周海胜2，查晓军2，张桂霞1，金福泉3，季 爽4，潘海峰5，叶冬青5，郝 丽1

目的建立稳定敲低单免疫球蛋白白介素1相关受体（SIGIRR）基因的人肾小管上皮细胞株（HKC），并初步研究其功能。方法 针对SIGIRR基因的有效靶点设计shRNA序列，与GV248-GFP-Puro慢病毒载体连接产生重组体（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR）。将测序验证正确的重组体与包装质粒（pMDL、pRev、pVSVG）共转染293T细胞进行病毒包装，收集病毒并感染HKC细胞。实时荧光定量PCR（qRTPCR）和Western blot法分析检测HKC细胞中SIGIRR干涉效率。应用白细胞介素-1β（IL-1β）刺激成功敲低SIGIRR的HKC细胞及对照细胞，Western blot法检测其下游核转录因子NF-κB（p65）的磷酸化水平，qRT-PCR分析单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋白（RANTES）mRNA水平。结果成功构建重组慢病毒载体GV248-GFP-Puro-shSIGIRR。qRT-PCR和Western blot法均证实在HKC细胞中成功敲低SIGIRR的表达。此外，IL-1β刺激后，与对照细胞相比，敲低SIGIRR的HKC细胞（HKC／shSIGIRR）的p65磷酸化水平上调，MCP-1和RANTES mRNA表达水平升高。结论 HKC的炎症反应中，SIGIRR蛋白对Toll样受体／白介素1受体（TLR／IL-1R）通路起“刹车”作用。该研究为狼疮性肾炎的治疗提供了新的潜在的靶点。

狼疮性肾炎；人肾小管上皮细胞；SIGIRR；慢病毒载体；NF-κB；趋化因子

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）最常见的并发症之一，而肾脏受累的严重程度对SLE患者死亡率及预期寿命有显著影响［1－2］。但LN发病机制尚未完全明确。研究［3－7］提示LN的发生和发展与肾小管上皮细胞内Toll样受体／白介素1受体（Toll-like receptor／IL-1 receptor，TLR／IL-1R）信号通路的活化有关，核转录因子NF-κB激活，产生趋化因子［如单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋白（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）］调节炎症细胞向肾组织浸润和活化。有研究［8－9］提示单免疫球蛋白白介素1相关受体（single immunoglobin IL-1-related receptor，SIGIRR）对TLR／IL-1R信号通路起负调控作用，因此有望成为LN治疗新的潜在的靶点。该研究以人肾小管上皮细胞（human renal tubule epithelial cells，HKC）作为模型，构建针对SIGIRR基因的小发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）的慢病毒表达载体，包装成病毒感染HKC细胞，建立SIGIRR稳定下调的HKC细胞系（HKC／shSIGIRR），并探讨在TLR／IL-1R信号通路激动剂白细胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）诱导下，NF-κB（p65）的磷酸化水平和其下游靶基因MCP-1和RANTES趋化因子mRNA水平的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株、菌株与载体 HKC细胞购自北京协和细胞资源中心；293T细胞由实验室保存；Top10感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司；GV248-GFP-Puro购自上海吉凯基因化学技术有限公司；pMDL、pRev和pVSVG质粒由实验室保存。

1.1.2抗体及主要试剂 兔抗SIGIRR抗体购自美国Ori Gene公司；兔抗p-p65抗体和兔抗p65抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH抗体购自美国Abcam公司；IL-1β购自美国Pepro Tech公司；Polybrene购自美国Millipore公司；嘌呤霉素购自美国Santa Cruz Biotechnologyinc公司；NuPAGE 10%Bis-Tris GEL 1.5 mm×10 Well、LipofectaminTM2000和Opti-MEM培养基购自美国Life Technologies公司；DMEM／F12、DMEM／高糖培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；Age I和EcoR I购自美国New England Biolabs公司；质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas公司；T4DNA连接酶和SYBR®Premix Ex TaqTM购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 HKC细胞采用含10%胎牛血清的DMEM／F12培养基培养。293T细胞培养条件为含10%胎牛血清DMEM／高糖培养基培养。37℃、5.0%CO2饱和湿度的培养箱中培养。当细胞在对数生长期，状态良好并且密度达到约80%时，使用0.25%的胰蛋白酶消化后，进行传代、冻存或其他实验。

1.2.2慢病毒干涉载体构建及包装 SIGIRR特异性干涉序列选自Public TRC Portal网站（http：／／www.broadinstitute.org／rnai／public／gene／search），从中选取3个靶序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成3对单链DNA序列。见表1。退火处理后连接至GV248-GFP-Puro慢病毒载体。见图1A。将重组体命名为GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-1＃、GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-2＃、GV248-GFP-PuroshSIGIRR-3＃。转化Top10大肠杆菌、挑选阳性克隆、提取质粒，由上海生工生物工程股份有限公司测序验证。

取成功构建的重组慢病毒载体及GV248-GFPPuro-shScramble（实验室先前构建，序列见表1）分别和包装质粒（pMDL、pRev、pVSVG）共转染293T细胞。转染前2 h将细胞培养基更换为Opti-MEM培养基。转染后混合培养8 h后更换含10%血清的DMEM／高糖培养基继续培养。因载体带有绿色荧光蛋白报告基因，24 h后可观察转染效率。转染后48、72 h，收集含有病毒的上清液。将收集的上清液1 500 r／min离心5 min，0.45 μm的滤膜过滤，－80℃储存、备用。

1.2.3孔稀释法测定病毒滴度 测定前1 d将生长状态良好的293T细胞消化稀释至1.0×105／ml，加入96孔板，100 μl／孔，每个病毒10个孔。感染当日将含有病毒的上清液，在EP管中做连续10个 10倍梯度稀释。弃去96孔板中原有的培养基，将稀释好的病毒液100 μl／孔加到细胞孔中，继续培养24 h后，每孔加入100 μl新鲜培养液。72 h后观察荧光并计数最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞个数。病毒滴度（TU／ml）＝荧光细胞个数×稀释倍数／病毒体积。

表1 3对单链及shScramble DNA序列

1.2.4慢病毒感染HKC细胞及稳定筛选 接种状态良好的HKC细胞至6孔板，密度约40%，待细胞贴壁后，按照病毒定量结果加入病毒上清液，同时加入Polybrene至终浓度为6 μg／ml。6 h后更换完全培养基。次日重复感染1次，72 h后荧光显微镜下观察感染情况，加入嘌呤霉素2 μg／ml继续筛选培养2周，直至单克隆细胞群形成。

1.2.5细胞总RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测 使用UNIQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定其浓度和光密度（optical density，OD）OD260／OD280比值，并且采用1%普通琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行快速分析。取1 000 ng总RNA，使用RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit对RNA进行反转录成总cDNA，并稀释20倍作为qRT-PCR检测模板。利用SYBR®Premix Ex TaqTM进行qRTPCR检测，引物序列见表2。反应体系为20 μl，每组样品设置3个重复；扩增程序：95℃预变性2 min、94℃变性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环。

1.2.6细胞总蛋白提取和Western blot法检测 收集细胞总蛋白前，PBS清洗2次，加入Western blot细胞裂解液在冰上裂解30 min，100℃水浴10 min，制备细胞总蛋白样品。采用NuPAGE 10%Bis-Tris GEL 1.5 mm×10 Well分离胶电泳分离细胞总蛋白，湿转法将蛋白转移至PVDF膜后，将其置于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中，室温摇床上封闭45 min。根据目标蛋白不同分子量大小切取PVDF膜条带置于按要求稀释的一抗中，4℃摇床上孵育过夜。次日将TBST洗脱后的PVDF膜条带再置于按要求稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育5 h后，TBST洗脱，暗室中超敏X线片曝光显示结果，灰度扫描分析软件计算各区带密度值。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.7IL-1β诱导实验 将HKC、HKC／shScramble（GV248-GFP-Puro-shScramble感染的HKC细胞）、HKC／shSIGIRR（已证明稳定敲低SIGIRR的HKC细胞）细胞接种至12孔板培养，分为2组，一组在对数生长期加入终浓度为10 ng／ml的IL-1β，另一组正常培养，24 h后分别收集细胞总RNA、总蛋白用于实验研究。该实验重复3次。

1.3 统计学处理采用SPSS 10.0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 成功构建GV248-GFP-Puro-shSIGIRR慢病毒载体经双酶切的GV248-GFP-Puro与退火后的shRNA连接后产生3个重组慢病毒载体。转化Top10大肠杆菌，长出克隆后提取质粒，由上海生工生物工程股份有限公司测序证实插入序列正确，说明成功构建载体。见图1。

2.2 慢病毒包装和滴度测定并成功高效感染HKC细胞构建的重组慢病毒载体和GV248-GFP-PuroshScramble分别和包装质粒共转染293T细胞，24 h后荧光显微镜下观察均可见大量荧光，提示转染成功。见图2。采用孔稀释法测定慢病毒滴度为（4× 107～6×107）TU／ml。将收集的慢病毒连续2次感染HKC细胞后，72 h后荧光显微镜观察显示80%以上HKC细胞表达荧光蛋白，提示成功感染。见图3。

2.3 HKC细胞中SIGIRR干涉效果检测提取经嘌呤霉素筛选2周后的HKC／shScramble、HKC／shSIGIRR-1＃（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-1＃感染的HKC细胞）、HKC／shSIGIRR-2＃（GV248-GFP-PuroshSIGIRR-2＃感染的HKC细胞）、HKC／shSIGIRR-3＃（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR-3＃感染的HKC细胞）与HKC的总RNA和总蛋白。qRT-PCR和Western blot法分析结果提示HKC／shSIGIRR-2＃与HKC／shSIGIRR-3＃中的SIGIRR表达均受到干涉，后者更加明显。在mRNA和蛋白水平上，与HKC／shScramble相比HKC／shSIGIRR-3＃敲低SIGIRR表达＞70%（t＝6.289，P＜0.01；t＝5.562，P＜0.01）。见图4。因此成功获得稳定敲低SIGIRR基因的HKC细胞株—HKC／shSIGIRR-3＃命名为HKC／shSIGIRR，用于下一步的细胞实验分析。

2.4 IL-1β诱导HKC／shSIGIRR后核转录因子NF-κB（p65）的磷酸化与MCP-1和RANTES趋化因子mRNA的变化Western blot法分析经IL-1β（10 ng／ml，24 h）诱导和未诱导的HKC、HKC／shScramble和HKC／shSIGIRR的各组细胞p65磷酸化水平改变情况。结果显示敲低SIGIRR基因，其下游基因p65的磷酸化水平较HKC／shScramble明显升高（t＝2.941，P＜0.05）。提示在HKC细胞中，敲低SIGIRR解除了SIGIRR对TLR／IL-1R信号通路的抑制，导致NF-κB过度激活。见图5。NF-κB信号的激活会通过增强下游趋化因子的表达从而参与LN的发生和发展。因此，需进一步分析敲低SIGIRR是否会影响NF-κB下游靶基因（MCP-1、RANTES）的表达。收集经IL-1β（10 ng／ml，24 h）诱导和未诱导的HKC、HKC／shScramble和HKC／shSIGIRR的总RNA，经qRT-PCR分析显示：与HKC／shScramble相比，敲低SIGIRR的HKC细胞中MCP-1和RANTES的mRNA表达水平均明显升高（t＝3.189，P＜0.05；t＝2.838，P＜0.05），见图6。

3 讨论

TLR／IL-1R信号通路在炎症反应和天然防御免疫中起着重要作用，当TLR／IL-1R与IL-1及某些TLR激动剂（如脂多糖、IL-1β等）配体结合后，TLR／IL-1R信号即被触发，其通过MyD88依赖通路或MyD88非依赖通路激活NF-κB，NF-κB可参与MCP-1和RANTES等多种趋化因子的表达，募集炎症细胞聚集发生炎症反应，但TLR／IL-1R信号通路过度激活可造成机体免疫损伤［4－8］。为避免该现象的发生，体内尚存有相应负调控成分以保证机体免疫反应的适度和稳定，广泛表达在肾小管上皮细胞、消化道和肺等器官组织的SIGIRR便是其中之一。人SIGIRR定位于11 p15.5，虽然SIGIRR属于TLR／IL-1R超家族中的IL-1R亚族，然而在功能上，不能介导TLR／IL-1R的炎症信号转导，相反还可能抑制TLR／IL-1R信号的下传，起到“刹车”作用，但其作用机制目前尚不明确［8］。

Lech et al［10］发现，敲除SIGIRR基因的B6lpr／lpr鼠表现为狼疮自身抗原诱导的树突细胞激活增加及B细胞增殖、多种自身抗体产生增多、肾小球单核细胞浸润增多及组织损伤加重。在碳氢化合物诱导的狼疮模型中，SIGIRR敲除小鼠血清自身抗体、尿蛋白量及LN活动指数均明显升高［11］。另一方面，学者［12－13］在肿瘤细胞系A549、H292等细胞中发现过度表达SIGIRR，也能够抑制NF-κB的活化，减少IL-1β、TNF-α等细胞因子的分泌，这说明SIGIRR可以阻断肿瘤细胞中TLR／IL-1R-NF-κB信号通路的激活从而缓解癌症中过度的炎症反应。提示SIGIRR在炎症反应的发生和发展中扮演着重要的角色，但是在肾小管上皮细胞的炎症反应中，SIGIRR蛋白对TLR／IL-1R通路是否起到抑制作用，国内尚未见报道。

特异性强、效率高的RNA干扰技术，提供了一个逆向研究SIGIRR基因在自身免疫性疾病分子病因中作用的方法，而设计和构建敲低靶基因的shRNA表达慢病毒载体是实验的核心技术［14－15］。该研究成功构建的重组慢病毒干涉载体，经过实验证明能够有效干涉HKC细胞中SIGIRR的表达，经过嘌呤霉素筛选后构建成稳定敲低SIGIRR的HKC细胞。本研究显示对SIGIRR敲低后，在IL-1β诱导下NF-κB（p65）的磷酸化水平和趋化因子MCP-1和RANTES mRNA表达增加，阐述了SIGIRR能够在HKC细胞的炎症反应中对TLR／IL-1R通路起到“刹车”作用。该研究为进一步探索SIGIRR在TLR／IL-1R通路或者其他信号传导通路中的功能研究奠定基础。为SIGIRR作为生物制剂进行干预治疗LN带来了一线曙光。

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Construction of SIGIRR stable knockdown human renal tubular epithelial cells and exploration of its function

Jiang Keguo1，Wang Deguang1，Zhou Haisheng2，et al
（1Dept of Nephrology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medicine Basical，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo establish single immunoglobin IL-1-related receptor（SIGIRR）stable knockdown human renal tubular epithelial cells（HKC）and explore its function.MethodsDesigned the effective targeted shRNA sequences for the SIGIRR gene，and then connected with the GV248-GFP-Puro to produce recombinant lentiviral vector（GV248-GFP-Puro-shSIGIRR）.The corrected recombinants，identified by sequenced，were transfected into 293T cells with packaging plasmids（pMDL，pRev，pVSVG）for virus packaging.HKC cells were then infected by packaged viruses.Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）and Western blot were used to detect the interference efficiency of SIGIRR in HKC cells.SIGIRR stable knockdown HKC cells（HKC／shSIGIRR）and the control cells were induced by IL-1β，then the downstream nuclear transcription factor，the phosphorylated NF-κB（p65）were detected by Western blot.The mRNA expression levels of chemokine monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）and regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor（RANTES）were analyzed by qRT-PCR.ResultsTheResultsshowed that the recombinant lentiviral vector GV248-GFP-Puro-shSIGIRR was successfully constructed.qRT-PCR and Western blot confirmed that SIGIRR was knockdown in HKC cells.Moreover，theResultsalso showed that compared with the control cells，the phosphorylated NF-κB（p65）and the mRNA levels of MCP-1 and RANTES were significantly increased in HKC／shSIGIRR cells by being stimulated with IL-1β.ConclusionTheResultssuggest that SIGIRR acts as a“brake”of inflammatory reaction in Toll-like receptor／IL-1 receptor（TLR／IL-1R）pathway in HKC cells.The study may provide a potential new target for the treatment of Lupus nephritis.

lupus nephritis；human renal tubular epithelial cells；SIGRR；lentiviral vector；NF-κB；chemokine

R 593.24＋2；R 392.11

1000－1492（2015）02－0129－07

2014－10－23接收

安徽省博士后科学基金（编号：9101019202）；中国博士后科学基金（编号：2012M511399）；国家自然科学基金（编号：81101524、81372475、81172591）

1安徽医科大学第二附属医院肾脏内科，合肥 230601安徽医科大学2基础医学院生物化学与分子生物学教研室、3药学院、4第一临床学院、5公共卫生学院流行病与卫生统计系，合肥 230032

蒋克国，男，主治医师，硕士研究生；王德光，男，主任医师，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangdeguang＠ahmu.edu.cn；周海胜，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：haishengs＠ahmu.edu.cn；查晓军，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：zhaxiaojunpumc＠gmail.com