尿液POU4F2基因甲基化对膀胱尿路上皮癌早期诊断的意义

王永强，于 源，安 丹，姜会玲，林友成，吴 松，蔡志明

尿液POU4F2基因甲基化对膀胱尿路上皮癌早期诊断的意义

王永强1，2，于 源3，安 丹3，姜会玲1，林友成4，吴 松2，蔡志明1，2

目的寻找在中国人群中具有高敏感性、高特异性的膀胱癌甲基化标志物，以应用于膀胱癌的尿液诊断。方法先用T24细胞系筛选8种文献报道的膀胱癌甲基化标志物，再利用甲基化特异性荧光定量PCR（qMSP）技术分别在28例膀胱癌患者、10例尿路结石伴感染患者和30例健康志愿者尿液样品中检测筛选成功的4种甲基化标志物，计算出不同组合的敏感性和特异性。结果PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的敏感性分别为46.43%、92.86%、39.29%、46.43%，特异性分别为95.00%、97.50%、97.50%、100.00%，最优的诊断标志物为POU4F2（敏感性92.86%、特异性97.50%）。结论 应用qMSP技术，以POU4F2为甲基化标志物在尿液中检测膀胱癌可能会成为一种临床可用的诊断方式。

膀胱癌；qMSP；甲基化；诊断

膀胱癌发病率在全身肿瘤发病率中居第九位，严重危害人类的健康［1］。由于早期膀胱癌常不显示症状，不易发现，因而早诊断、早治疗对膀胱癌患者的预后具有极大的帮助。开发高灵敏、高特异性的膀胱癌无创检查是膀胱癌检测和监控手段的发展方向。膀胱癌的发生与基因组水平的改变相关，同时亦发生表观遗传学上的改变如DNA甲基化和组蛋白修饰等［2－4］。DNA甲基化异常可通过影响染色质结构及癌基因和抑癌基因的表达而参与膀胱癌的形成。因此，特定基因的DNA甲基化可作为生物标志物诊断和监测膀胱癌。甲基化特异性PCR（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）是目前检测DNA甲基化最敏感的技术，能发现0.1%的甲基化DNA（＞50 pg）。近些年产生的甲基化特异性荧光定量PCR（quantitative methylationspecific polymerase chain reaction，qMSP）技术是实时定量基因扩增荧光检测系统与MSP技术的结合，利用qMSP技术检测膀胱癌的方法有诸多报道［5－8］，但研究主要局限于欧美人种，且不同种族间的基因甲基化情况差异较大。该研究利用qMSP技术在中国人尿液中检测多种肿瘤标志物，以期达到早期无创诊断膀胱癌的目的。

1 材料与方法

1.1 病例资料选择2013年2月～2014年4月在安徽医科大学第一附属医院泌尿外科、中山大学肿瘤医院泌尿外科、南方医科大学珠江医院泌尿外科膀胱癌患者尿液样品28份作为膀胱癌组，尿路结石伴感染患者尿液样品10份作为尿感染组，健康志愿者尿液样品30份作为正常组，临床资料见表1。尿液样品均为中段晨尿，采集后立即用低温离心机4℃，2 000 r／min离心15 min后，去上清液，留沉淀进行DNA提取。患者及其家属自愿签署知情同意书。

1.2 主要试剂天根组织／血液DNA提取试剂盒、天根微量样品基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；dsDNA HS分析试剂盒、实时荧光定量PCR系统、96孔PCR仪、核酸蛋白定量仪2.0（美国Life Technologies公司）；DNA甲基化试剂盒（美国ZYMO Research公司）；TaKaRa RT-PCR试剂盒、TaKaRa premix taq ver 2.0 plus dye（大连宝生物工程有限公司）；低温高速离心机（BECKMAN 64R）（美国Beckman Coulter公司）。T24膀胱癌细胞系由深圳北大医院中心实验室赠予。引物序列参考文献［5－8］，见表2。

1.3 方法

1.3.1实验组与对照组 实验组为膀胱癌患者，记为BC；对照组为尿路结石伴感染患者及健康志愿者，分别记为U和N。

1.3.2DNA提取 采用天根微量样品基因组DNA提取试剂盒对尿沉渣进行DNA提取，提取流程参照试剂盒说明书。采用天根组织／血液DNA提取试剂盒对T24细胞进行DNA提取，提取流程参照试剂盒说明书。

1.3.3样品检测

1.3.3.1浓度检测 检测方法按照Quant-it dsDNA HS Assay Kit的说明书中步骤进行。注意每日首次使用Qubit时，均需要制作标准曲线，且要用2 μl standard2＃作为阳性对照，检验标准曲线的准确性，只有当standard2＃检测的浓度在下面范围内标准曲线才能使用。Qubit HS阳性对照（standard2＃）检测浓度范围9.5～10.5 ng／μl。

1.3.3.2样品完整性检测方法 根据Qubit定量的浓度，取约50 ng DNA，与3 μl溴酚蓝混合，补水至10 μl后，全部加入到1%琼脂糖检测胶的胶孔中，样品应同时包括2条分子量标准：λ-Hind Ш digest（上样量2 μl）及D2000（上样量6 μl）。电泳条件：电压150 V电泳40 min。将电泳完成的胶块置于凝胶成像仪中拍照保存。拍照时注意胶图背景较暗，胶孔要清晰。选择DNA总量＞500 ng，片段大小＞10 000 bp的样本进行后续实验。

1.3.4Bisulfite处理 Bisulfite处理的样本起始量为200 ng，具体实验方法和注意事项根据ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTMKit的说明书进行操作，纯化时用20 μl的M-Elution Buffer洗脱DNA。Bisulfite反应体系：CT Conversion Reagent 130 μl，DNA模板200 ng，灭菌双蒸水补足150 μl。所用仪器：96-Well GeneAmp PCR System 9700。反应条件：98℃、10 min，65℃、2.5 h，4℃维持。

1.3.5甲基化引物筛选 以经Bisulfite处理的T24细胞系DNA为模版，选取各个引物分别进行PCR。反应体系：模版30 ng、TaKaRa®premix taq 25 μl、上下游引物各1 μl、灭菌双蒸水补足至50 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃30s，扩增40个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳分析。没有条带的视为引物筛选失败，选取ALU-C4作为内参，PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154作为甲基化标志物进行后续实验。见图1。

1.3.6qMSP检测 对经Bisulfite处理的DNA样本进行qMSP，每个样本检测ALU-C4、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154 5对引物。反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM II（2×）10 μl、引物（10 μM）2 μl、ROX Reference Dye（50×）0.4 μl、DNA模板2 μl、Naclease-Free Water 5.6 μl，共20 μl体系。反应条件：95℃预变性5 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s扩增45个循环。每个反应重复3次，取3次结果的平均CT值作为最终结果。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析，数据以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 甲基化拷贝数计算用5个基因ALU-C4、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每对引物纯化后的RT-PCR产物制作标准曲线，做出每对引物的标准曲线［9］，通过标准曲线定出每个基因的实际甲基化的拷贝数。见图2。

表2 qMSP内参及甲基化标志物

2.2 相对甲基化水平计算将实际甲基化的拷贝数代入以下公式，计算出相对甲基化水平值。相对甲基化水平值＝［（gene／ALU）sample／（gene／ALU）Standard］×1 000。

2.3 3 组间相对甲基化水平差异比较PCDH17基因：正常组（46.88±72.17）、膀胱癌组（382.67± 440.00）、尿路感染组（286.93±489.52），3组间差异有统计学意义（F＝7.267，P＜0.01）。POU4F2基因：正常组（0.35±0.50）、膀胱癌组（104.55± 94.74）、尿路感染组（9.63±28.87），3组间差异有统计学意义（F＝22.321，P＜0.01）。TCF21基因：正常组（24.82±36.95）、膀胱癌组（169.85± 169.52）、尿路感染组（78.71±41.79），3组间差异有统计学意义（F＝11.997，P＜0.01）。ZNF154基因：正常组（43.68±89.86）、膀胱癌组（480.96± 425.70）、尿路感染组（110.52±89.65），3组间差异有统计学意义（F＝18.420，P＜0.01）。

2.4 检出限判定根据30个正常样本中各基因的最大相对甲基化水平值确定各基因的检出限，PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的检出限分别为300.17、1.95、154.56、427.99。见图3。

2.5 结果判定相对甲基化水平值高于检出限判定为阳性，等于或低于检出限判定为阴性。见表1。多种标志物联用时，其中任一标志物阳性即判定为阳性结果。敏感性＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数／总的膀胱癌样本数，特异性＝检测结果为阳性的非膀胱癌样本数／总的非膀胱癌样本数。见表3。

表3 甲基化标志物的敏感性和特异性

3 讨论

膀胱癌分为尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺细胞癌、小细胞癌、混合型癌、癌肉瘤以及转移性癌等，其中以尿路上皮癌最常见，占90%以上。膀胱独特的生理环境使得膀胱癌无创诊断成为可能，膀胱上皮细胞脱落至尿液中，可随尿液排出体外，便于诊断。目前经美国食品和药物管理局批准用于临床的膀胱癌相关的无创诊断方法有尿细胞学、膀胱肿瘤抗原、核基质蛋白22、ImmunoCyt、荧光原位杂交，但其均存在一定的缺点，并不适合大规模高危人群筛查。

DNA甲基化状态易于DNA序列发生改变，其对环境变化的敏感性更高，在细胞发生癌变的早期即可发现甲基化状态的变化。因此，利用甲基化标志物诊断膀胱癌更适合高危人群筛查，且有利于发现癌前病变［5］。国外已有文献［5－8，10］报道了膀胱癌特异的甲基化标志物，并利用MSP及qMSP技术在尿液中鉴别膀胱癌患者与正常个体，取得了较好的效果。但是这些研究主要集中在欧美国家，不同人种间的DNA甲基化状态差异较大，这些甲基化标志物是否适用于中国人尚不清楚。

本研究选取了PCDH17、TCF21、VIM、POU4F2、ZNF154、TMEFF2、TWIST1、NID2共8个基因进行筛选，经过PCR产物电泳鉴定后选取PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154作为甲基化标志物进行后续实验。PCDH17是原钙黏蛋白家族的成员之一。PCDH17基因位于13q21.1，主要编码钙黏蛋白相关的神经受体，在特异的细胞与细胞之间的连接与功能中起作用［11］。有研究［12］报道PCDH17主要通过增加细胞间的黏附、信号转导及生长控制而起到一定的抑癌作用。POU4F2是POU家族蛋白的一员，POU家族蛋白是包含有POU结构域的一类转录调控因子。POU4F2维持视神经元功能，研究［13］显示POU4F2在乳腺癌中表达升高，起到促进肿瘤生长的功能。TCF21基因位于人类6号染色体6q23-24区域，研究［14］报道TCF21基因能够促使间质细胞转化为上皮细胞，这个过程的逆转就是上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），TCF21基因的低表达会导致EMT，与多种肿瘤的侵犯和转移有关。ZNF154与细胞的生长分化功能有关。ZNF154基因的高甲基化与非浸润性膀胱癌的复发有关［10］。

通过在28例膀胱尿路上皮癌患者、10例尿路结石伴感染患者、30例健康志愿者尿液样品中进行qMSP检测，确定了4个标志物的检出限分别为PCDH17 300.17、POU4F2 1.95、TCF21 154.56、ZNF154 427.99。最终发现以POU4F2单一甲基化标志物可达到最好的效果，敏感性92.86%，特异性97.50%。

利用qMSP技术诊断膀胱癌具有极高的敏感性，对早期膀胱癌检出率高。本研究在实验过程中共收集膀胱癌患者尿液75例，但提取出DNA符合qMSP实验要求的只有28例，与Reinert et al［10］尿液DNA的提取成功率（约30%）相当。这可能是膀胱癌尿液甲基化诊断方式已诞生多年，但仍未推广应用于临床的技术难题之一。尿液采集前受检者的饮水、活动状态、尿液离体后的处理方式及时间、保存方式及提取方式等都有可能对提取成功率产生影响。要将尿液甲基化诊断膀胱癌推广于临床应用，必须要改变现有的尿液DNA保存及提取方式，达到提取成功率90%以上，而后进行大样本、多中心研究及实验证实。

［1］ Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9－29.

［2］ Esteller M.Epigenetic gene silencing in cancer：the DNA hypermethylome［J］.Hum Mol Genet，2007，16（R1）：R50－9.

［3］ Laird P W.The power and the promise of DNA methylation markers［J］.Nat Rev Cancer，2003，3（4）：253－66.

［4］ Esteller M.Cancer epigenomics：DNA methylomes and histonemodification maps［J］.Nat Rev Genet，2007，8（4）：286－98.

［5］ Chung W，Bondaruk J，Jelinek J，et al.Detection of bladder cancer using novel DNA methylation biomarkers in urine sediments［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20（7）：1483－91.

［6］ Costa V L，Henrique R，Danielsen S A，et al.Three epigenetic biomarkers，GDF15，TMEFF2，and VIM，accurately predict bladder cancer from DNA-based analyses of urine samples［J］.Clin Cancer Res，2010，16（23）：5842－51.

［7］ Costa V L，Henrique R，Danielsen S A，et al.TCF21 and PCDH17 methylation：An innovative panel of biomarkers for a simultaneous detection of urological cancers［J］.Epigenetics，2011，6（9）：1120－30.

［8］ Renard I，Joniau S，van Cleynenbreugel B，et al.Identification and validation of the methylated TWIST1 and NID2 genes through real-time methylation-specific polymerase chain reaction assays for the noninvasive detection of primary bladder cancer in urine samples［J］.Eur Urol，2010，58（1）：96－104.

［9］ Lee C，Kim J，Shin S G，et al.Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli［J］.J Biotechnol，2006，123（3）：273－80.

［10］Reinert T，Borre M，Christiansen A，et al.Diagnosis of bladder cancer recurrence based on urinary levels of EOMES，HOXA9，POU4F2，TWIST1，VIM，and ZNF154 hypermethylation［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46297.

［11］Yagi T.Clustered protocadherin family［J］.Dev Growth Differ，2008，50 Suppl 1：S131－40.

［12］Haruki S，Imoto I，Kozaki K，et al.Frequent silencing of protocadherin 17，a candidate tumour suppressor for esophageal squamous cell carcinoma［J］.Carcinogenesis，2010，31（6）：1027－36.

［13］Fujita R，Ounzain S，Wang A C，et al.Hsp-27 induction requires POU4F2／Brn-3b TF in doxorubicin-treated breast cancer cells，whereas phosphorylation alters its cellular localisation following drug treatment［J］.Cell Stress Chaperones，2011，16（4）：427－39.

［14］Baum B，Settleman J，Quinlan M P.Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease［J］.Semin Cell Dev Biol，2008，19（3）：294－308.

Diagnosis of bladder cancer based on urinary levels of POU4F2 hypermethylation

Wang Yongqiang1，2，Yu Yuan3，An Dan3，et al
（1Anhui Medical University，Hefei 230032；2Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen 518035；3Beijing Genomics Institute at Shenzhen，Shenzhen 518083）

ObjectiveTo identify a panel of novel epigenetic biomarkers with high sensitivity and specificity that can be utilized in detection and diagnosis of bladder cancer using urine sediments.MethodsT24 cell lines that had been treated with bisulfite were used to examine the 8 methylated candidates that were previously reported in bladder cancer patients.Methylation levels of the candidate genes were quantified using the urine sediments from 28 bladder cancer patients，30 healthy volunteers and 10 infected urinary calculi patients by quantitative methylationspecific polymerase chain reaction（qMSP）.The four most efficacious and reliable biomarkers were selected after the sensitivity and specificity of each biomarker were further calculated and inspected.ResultsThe sensitivities of PCDH17，POU4F2，TCF21 and ZNF154 in the detection of bladder cancer were 46.43%，92.86%，39.29%and 46.43%respectively；the specificities of these biomarkers were 95.00%，97.50%，97.50%and 100.00%respectively.POU4F2 appeared as the best biomarkers among the four，showing a sensitivity of 92.86%and a specificity of 97.50%.ConclusionBladder cancer can be detected by a biomarker panel by using qMSP depending on the urine samples from patients.

bladder cancer；qMSP；hypermethylation；diagnosis

R 737.14；R 394.3；R 446.12

1000－1492（2015）02－0144－06

2014－10－13接收

国家重点基础研究发展计划（973计划项目）（编号：2014CB745200）

1安徽医科大学，合肥 2300322深圳市第二人民医院，深圳 5180353深圳华大基因研究院，深圳 5180834南方医科大学珠江医院，广州 510280

王永强，男，硕士研究生；吴 松，男，研究员，责任作者，E-mail：doctor＿wusong＠126.com；蔡志明，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：caizhiming2000＠163.com