绿色魏斯氏菌ORC4的抗氧化、降胆固醇作用

刘长建， 刘 秋， 姜 波， 闫建芳， 齐小辉

（大连民族学院 生命科学学院，辽宁 大连 116600）

绿色魏斯氏菌ORC4的抗氧化、降胆固醇作用

刘长建， 刘 秋*， 姜 波， 闫建芳， 齐小辉

（大连民族学院 生命科学学院，辽宁 大连 116600）

从风干香肠中分离得到一株生长良好的乳酸菌ORC4，菌株能产乳酸、革兰氏染色阳性、接触酶阴性。经系统发育分析，结合菌落形态、细胞形态、生化反应试验，确定菌株ORC4为绿色魏斯氏菌。绿色魏斯氏菌ORC4的完整和破碎细胞对O2-·、DPPH·和·OH的清除率都与细胞浓度呈正相关。在细胞浓度为5×108CFU/mL时，菌株ORC4破碎细胞对O2-·、DPPH·和·OH的清除率都高于完整细胞，分别为45.17%、56.17%和54.01%。菌株ORC4还能清除培养基中最多为

风干香肠；绿色魏斯氏菌；16S rDNA；系统发育树；抗氧化作用；降胆固醇作用

魏斯氏菌属（Weissella）与乳杆菌属十分相似，也是兼性厌氧、触酶阴性、革兰氏阳性，但呈链状排列的短杆形或类球形。魏斯氏菌作为乳酸菌广泛存在于肉制品、泡菜等发酵食品中，通过16S rRNA序列、23S rRNA序列的研究发现，与乳杆菌属、明串珠菌属相近的这一个族群应放在属的分类位置，Collin等提出了魏斯氏菌属（Weissella）[1]，并在1994年得到确认[2]。当时共有7个种都归到该属，包括Niven等1957年从熏肉中分离到的新种，最初命名为Lactobacillus viridescens[3]，而现在命名为Weissella viridescens，是这个属的第一个被分离的种，并作为该属的模式菌株。2013年分别从驼螽的消化道[4]、发酵可可豆[5]和发酵的谷物[6]中又分离到3个新种，到现在魏斯氏菌属共有18个种。

食物发酵的通常乳酸菌属包括肉食杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、酒球菌属、片球菌属、链球菌属、四链球菌属、魏斯氏菌属[7]。而魏斯氏菌属是植物发酵初期的优势菌群，能提供了几种潜在的保健和营养作用[8]，包括食物的营养价值，控制肠道感染，改善乳糖的消化，控制胆固醇水平，以及多个癌症的发病[9]。因为乳酸菌的发酵产品能吸收血液中的胆固醇，降低血液中的胆固醇浓度，这对于预防动脉粥样硬化和心脑血管疾病是至关重要的[10-11]。同时乳酸菌还显示了具有非常强的清除氧自由基的能力，能在食用含有抗氧化作用的食物时，对其致癌作用的各个阶段起到预防作用[9]。作者从传统风干香肠中分离出乳酸菌，对其抗氧化活性等益生特性进行了体外评估，为乳酸菌替代抗氧化剂的应用和进一步研究打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料发酵食品风干香肠：购自大连市场；主要试剂胆固醇、乙酸等：国药集团化学试剂公司。邻苯二甲醛（Sigma），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Johnson Matthey）；PCR反应所用的相关试剂：购于大连宝生物。

1.1.2 主要仪器UV-2450分光光度计：日本岛津；DNP-9052恒温培养箱：上海精宏；JY92-IIN超声破碎仪：宁波新芝；TC-512基因扩增仪：Techne。

1.2 培养基

分离用培养基：MRS培养基（Merck）和M17培养基（Oxoid）。其它培养基：PY培养基、PYG培养基、含6.5、18 g/dL NaCl的MRS培养基[12]和含0.10 mg/mL胆固醇的胶束液体培养基[13-14]。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的初步分离及纯化取1.0 g样品加入9.0 mL无菌水室温浸泡24 h。连续稀释后涂布于含碳酸钙的两种分离固体培养基，37℃静置培养24～48 h。挑取产生溶钙圈的单菌落，纯化两次。筛选过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性、发酵产乳酸[15]的菌株进行下一步研究。

1.3.2 菌落形态、菌体细胞形态及生理生化特性乳酸菌接种平板后，37℃培养48 h后，记录菌落边缘形状、大小、颜色等菌落特征。同时高倍显微观察菌体革兰氏染色、个体形状、大小等细胞特征。分别测定菌株在10℃和45℃的生长情况、运动性、耐盐性、葡萄糖发酵产酸产气试验等生理生化特征[12]。

1.3.3 菌株的分子生物学鉴定将纯化得到的菌种在37℃条件培养2 d后，离心收集菌体；提取细菌总DNA。采用通用引物对其16S rDNA进行扩增，并进行测序后将序列输入NCBI核酸数据库中，与基因库核酸序列进行比对。并利用MEGA5.0软件中邻接法（Neighbor-Joining），采用Kimura-2参数模型进行系统发育树的构建[15]。

1.3.4 乳酸菌的降胆固醇性能测定邻苯二甲醛法的胆固醇标准曲线测定[16-17]，质量浓度范围为5～25 μg/mL。乳酸菌液体培养活化后，以5%接种体积分数接种于含胆固醇液体培养基，37℃分别培养24、36、48、60 h。摇匀后取菌悬液离心，取沉淀经冷冻干燥后称量干重；另取0.5 mL培养液加3 mL的95%乙醇，再加2 mL氢氧化钾乙醇溶液（12 g/dL）；充分混匀后60℃水浴加热20 min；迅速冷却后，加入5 mL正己烷，充分混匀（20 s～1 min），加3 mL无菌超纯水；取上清液加正己烷2.5 mL于10 mL具塞试管中，60℃氮吹干，加2 mL冰乙酸溶解，加2 mL显色剂 （1.0 mg/mL邻苯二甲醛/冰乙酸溶液）、2 mL浓硫酸迅速充分混匀；放置10 min，550 nm条件下测吸光度值[16-17]。根据标准曲线测定胆固醇浓度，同时测定培养基初始的胆固醇质量浓度。

1.3.5 乳酸菌的体外抗氧化试验取10 mL培养液，8 000 r/min离心10 min，无菌水洗涤3次，制成菌悬液，血球计数板计数并调整细胞浓度至109CFU/mL[15]。所得菌悬液分为两组，一组作为完整细胞组；另一组超声破碎仪280 W，间隔5 s处理5 s，至显微镜下检查没有完整菌体为止，大约10 min。采用Fenton体系测定乳酸菌对羟自由基 （·OH）的清除活性[15，18]；测定乳酸菌对DPPH自由基的清除活性[15，18]；邻苯三酚自氧化法测定乳酸菌对超氧阴离子自由基（O2－）的清除活性[15，18-19]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的初步筛选

共筛选出13株疑似乳酸菌，接触酶试验筛选出8株阴性菌株。高效液相色谱法对发酵液的检测结果表明，8株均产乳酸。选取生长较好的一株ORC4进一步研究。

2.2 菌株的多相鉴定

2.2.1 菌落、细胞形态及生长特性观察乳酸菌ORC4菌落呈乳白色、低凸面、表面光滑，直径小于0.3 mm；细胞呈近球形或者短杆状，革兰氏染色为阳性，见图1。兼性厌氧，不运动，不形成芽孢；6.5、18 g/dL NaCl和45℃条件均能生长，而在10℃不能生长，发酵葡萄糖产酸不产气，见表1。

2.2.2 16S rDNA序列分析以菌株 ORC4总的DNA为模板，获得了1条长度1 410 bp特异的扩增条带，序列的GenBank登录号为KC108670。通过Blast程序与数据库中序列进行比对，发现ORC4与Weissella viridescens NRIC 1536（T）的相似性为100%。将魏斯氏菌属现有18个种[20]的模式菌16S rRNA序列，与菌株ORC4进行聚类分析，见图2。菌株ORC4与W.viridescens NRIC 1536（T）在同一分支上。结合菌株的形态特征、生理生化特征，可以确定菌株ORC4属于魏斯氏菌属（Weissella）中的绿色魏斯氏菌（W.viridescens）。

图1 菌株细胞形态的显微观察（×100）Fig.1 Cells morphology of the strain（×100）

表1 菌株的生长特性Table 1 Growth characteristics of the strains

图2 菌株ORC4和参比明串珠菌属菌株的16S rDNA同源性的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain ORC4 and the reference strains

2.3乳酸菌的益生特性研究

2.3.1 乳酸菌降胆固醇能力测试室温条件下，测定胆固醇的标准曲线为：Y=6.539 3X+0.002 7，R2=0.998 5，说明胆固醇质量浓度（X）和吸光值（Y）呈良好的线性关系，可以用该法测定培养基中胆固醇的质量浓度。

乳酸菌ORC4能降低培养基中的胆固醇，见图3。随着培养时间的增加，胆固醇降解量和单位细胞干重的降胆固醇量均升高；而在36～48 h之间，胆固醇降解速度和单位细胞干重的降胆固醇速度都有明显增加的趋势；但在60 h，菌株ORC4能清除35.87 μg/mL的胆固醇，而单位细胞干重的降胆固醇量与48 h时相比基本不变，为19.87 μg/mg。

图3 培养时间对乳酸菌降胆固醇的影响Fig.3 Cholesterol-lowering ratio of LAB during growth

2.3.2 乳酸菌对自由基清除活性的测定由图4可以看出，乳酸菌ORC4的完整细胞和破碎细胞对O2-·、·OH和DPPH·均有清除能力，且清除率与细胞浓度（破碎细胞也以细胞浓度作为单位）呈正相关。当细胞浓度为5×108CFU/mL时，破碎细胞对三个自由基的清除率都大于45%，对DPPH的清除率最高，为56.17%；均高于完整细胞对自由基的清除（完整细胞的清除率均低于40%），完整细胞对·OH的清除率最低，只有14.73%。细胞破碎对·OH的清除率影响最大，达到54.01%。

3 结语

乳酸菌在自然界分布广泛，作者从发酵香肠中初步分离得到H2O2酶阴性、革兰氏阳性、发酵液产乳酸的乳酸菌13株，从中筛选到一株生长良好的乳酸菌ORC4。根据菌落、细胞形态、生理生化特性、以及16S RrDNA序列比对，可鉴定ORC4为绿色魏斯氏菌。

图4 完整细胞和破碎细胞对自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of intact cells and intracellular extract on hydroxyl radical

经过抗氧化测定试验，发现绿色魏斯氏菌ORC4对自由基O2-·、DPPH·和·OH都有一定的清除能力，其细胞浓度（包括完整细胞和破碎细胞）与自由基的清除率均分别呈正相关。在细胞浓度为5×108CFU/mL时，菌株ORC4破碎细胞对O2-·、DPPH·和·OH的清除率都大于45%；而完整细胞对3种自由基的清除率均低于40%；破碎细胞对·OH的清除率变化最大，完整细胞为14.73%而破碎细胞为54.01%。体外降胆固醇试验发现绿色魏斯氏菌ORC4具有降解培养基中胆固醇的能力，降解量随着培养时间的增加、菌体量的增长呈上升趋势，菌株ORC4在36～48 h对胆固醇的降解量增加明显；而在48 h后的降解趋势进入一个平稳期，单位细胞干重的降胆固醇量为19.89 μg/mg；在60 h时，胆固醇降解量是35.87 μg/mL。

当前对心血管疾病的药物治疗，因其相对成本高和相关联的副作用，不被认为是长期的最佳选择[9]。乳酸菌能通过改善肠道微生态平衡清除自由基实现延缓衰老[8]。国内外报道的相关乳酸菌种类主要集中在乳杆菌属，如嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等[21-22]。对魏斯氏菌属的抗氧化、降胆固醇能力的研究很少，本实验筛选出的一株绿色魏斯氏菌，并对其清除自由基、去除胆固醇的能力进行了研究，这样就可以充分利用乳酸菌开发出功能性发酵食品、提高发酵食品的附加值。

[1]Niven C F，Evans J B.Lactobacillus viridescens nov.spec.，a heterofermentative species that produces a green discoloration of cured meat pigments[J].J Bacteriol，1957，73（6）：758-759.

[2]Aguirre M，Collins M D.Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB[J].International Journal of System Bacteriology，1994，44（2）：370-371.

[3]Collins M D，Samelis J，Metaxopoulos J，et al.Taxonomic studies on some Leuconostoc-like organisms from fermented sausages：description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species[J].J Appl Bacteriol，1993，75：595-603.

[4]Oh S J，Shin N R，Hyun D W，et al.Weissella diestrammenae sp.nov.，isolated from the gut of a camel cricket（Diestrammena coreana）[J].Int J Syst Evol Microbiol，2013，63：2951-2956.

[5]Snauwaert I，Papalexandratou Z，De Vuyst L，et al.Characterization of strains of Weissella fabalis sp.nov.and Fructobacillus tropaeoli from spontaneous cocoa bean fermentations[J].Int J Syst Evol Microbiol，2013，63，1709-1716.

[6]Tohno M，Kitahara M，Inoue H，et al.Weissella oryzae sp.nov.，isolated from fermented rice grains[J].Int J Syst Evol，Microbiol，2013，63：1417-1420.

[7]Stiles M E，Holzapfel W H.Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy[J].Int J Food Microbiol，1997，36：1-29.

[8]Lin D C.Probiotics as functional foods[J].Nutr Clin Pract，2003，18：497-506.

[9]KIM JONG-EUN，KIM JI YEON，LEE KI WON.Cancer chemopreventive effects of lactic acid bacteria[J].J Microbiol Biotechnol，2007，17（8）：1227-1235.

[10]ZHENG Yongchen，LU Yingli，WANG Jinfeng.Probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from Tibetan Kefir grains[J]. PLOS ONE，2013，8（7）：e69868

[11]Sarkar S.Potential of acidophilus milk to lower cholesterol[J].Nutrition and Food Science，2003，33：273-277.

[12]凌代文.乳酸菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1998：117-128.

[13]刘长建，姜波，安晓雯，等.菠菜中降胆固醇乳酸菌的筛选及鉴定[J].食品与生物技术学报，2009，29（6）：937-940.

LIU Changjian,JIANG Bo,AN Xiaowen,et al.Isolation and identification of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from Spinach [J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，29（6）：937-940.（in Chinese）

[14]Psomas E I，Fletouris D J，Litopoulou-Tzanetaki E，et al.Assimilation of cholesterol by yeast strains isolated from infant feces and feta cheese[J].Journal of Dairy Science，2003，86（11）：3416-3422.

[15]刘长建，刘秋，姜波，等.鹑鸡肠球菌m661的抗氧化、降胆固醇作用[J].食品科学，2013，34（7）：157-161.

LIU Changjian,LIU Qiu,JIANG Bo,et al.Antioxidative probiotic properties of Enterococcus gallinarum for pig[J].Food Science，2013，34（7）：157-161.（in Chinese）

[16]LIU Hanlu，YANG Chenjie，JING Yi，et al.Ability of lactic acid bacteria isolated from mink to remove cholesterol：in vitro and in vivo studies[J].Can J Microbiol，2013，59：563-569.

[17]Rudel L L，Morris M D.Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde[J].J Lipid Res，1973，14：364-366.

[18]JIANG Bo，ZHANG Hongyan，LIU Changjian，et al.Extraction of water-soluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves[J].Med Chem Res，2010，19（3）：262-270.

[19]Issoufou Amadou，Olasunkanmi S Gbadamosi，Yong-Hui Shi，et al.Identification of antioxidative peptides from Lactobacillus plantarum Lp6 fermented soybean protein mea[J].Research Journal of Microbiology，2010，5（5）：372-380.

[20]Euzeby J P.List of bacterial names with standing in nomenclature：a folder available on the internet[J].Int J Syst Bacteriol，1997，47（2）：590-592.

[21]Alberto Amaretti，Mattia di Nunzio，Anna Pompei.Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria：in vitro and in vivo activities[J].Appl Microbiol Biotechnol，2013，97：809-817.

[22]ZHENG Yongchen，LU Yingli，WANG Jinfeng.Probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from Tibetan Kefir grains[J]. Plos One，2013，8（7）：698-699.

Antioxidative and Cholesterol-Rducing Ability of Weissella viridescens ORC4 from Dry Fermented Sausages

LIU Changjian， LIU Qiu*， JIANG Bo， YAN Jianfang， QI Xiaohui
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

A Gram （＋），non-motile，facultatively anaerobic，rod-or coccoid-shaped bacterium，designated strain ORC4，was isolated from the dry fermented sausages.The 16S rRNA gene sequence analysis showed that strain ORC4 belonged to the genus Weissella，with highest sequence similarity to Weissella viridescens NRIC1536（100%）.The intact cells and intracellular extract of strain ORC4 could inhibit O2-·，DPPH·，and·OH.Three free radicals-scavenging ratios of intracellular extract were positively correlated with bacterial density，respectively，the intact cells could do the same.The intracellular extract had higher scavenging ratios on three free radicals than the intact cells.At a concentration of 5×108CFU/mL，scavenging ratios of intracellular extract on O2-·，DPPH·and·OH were 45.17%，56.17%and 54.01%respectively.In addition，strain ORC4 could reduce 35.87 μg/mL cholesterol，and the unit cell dry weight of cholesterol removal rate was 19.89 μg/mg.

dry fermented sausages，Weissella viridescens，16S rDNA，phylogenetic tree，antioxidative effect，cholesterol-reducing ability

TS 201.3

A

1673—1689（2015）05—0512—05

2014-02-11

国家自然科学基金项目（31070005）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（DC12010103，DC120101034）。

刘长建（1975—），男，辽宁普兰店人，工学硕士，高级工程师，主要从事应用微生物方面的研究。E-mail：lcj@dlnu.edu.cn

*通信作者：刘 秋（1969—），女，辽宁普兰店人，农学博士，教授，硕士研究生导师，主要从事放线菌应用方面的研究。

E-mail：liuqiu@dlnu.edu.cn

35.87 μg/mL的胆固醇，单位细胞干重的胆固醇清除率为19.89 μg/mg。