热休克因子4b多克隆抗体制备及纯化

张原源,杨雅雯,董光耀,吴一凡,李朋飞,李淑莲

(河南大学医学院河南省抗体药物工程实验室,河南开封475004)

热休克因子4b多克隆抗体制备及纯化

张原源,杨雅雯,董光耀,吴一凡,李朋飞,李淑莲*

(河南大学医学院河南省抗体药物工程实验室,河南开封475004)

目的制备兔抗人热休克转录因子4b(Hsf4b)多克隆抗体。方法利用实验室已纯化的GST-Hsf4b融合蛋白免疫新西兰大耳白兔3次,制备Hsf4b多克隆抗体血清,ELISA方法检测血清抗体效价,饱和硫酸铵纯化血清多克隆抗体,Western blot检测多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合能力。结果ELISA检测显示,经过三次免疫,获得了高效价的兔抗人Hsf4b多克隆抗体;Western blot检测表明,制备的兔抗人Hsf4b多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合良好。结论成功制备了高效价的抗Hsf4b多克隆抗体,为研究Hsf4b生物学功能提供了有用的实验工具。

热休克因子4b;融合蛋白;多克隆抗体;ELISA

热休克转录因子4(heat shock transcriptionfactor 4,Hsf4)是一个新的调控晶状体早期发育的关键转录因子,其DNA结合区错义突变与人类家族性先天性常染色体显性及隐性白内障发生密切相关[1-2]。敲除小鼠Hsf4基因导致小鼠晶状体发育障碍,并形成核状白内障.病理变化表现为晶状体上皮细胞异常增生,纤维细胞分化障碍,细胞内形成蛋白质非溶解物[3]。Hsf4有Hsf4a、Hsf4b两种亚型,Hsf4b主要在晶状体组织中表达,是调节鼠晶状体发育的唯一亚型。Hsf4在晶状体发育过程中的调控机理目前仍不清楚。为了进一步研究Hsf4在晶状体发育过程中的生物学调控作用,应用实验室原核表达的GST-Hsf4b融合蛋白免疫动物,制备Hsf4b多克隆抗体,为研究Hsf4调控晶状体发育的机制提供有用工具。

1 材料与方法

1.1 材料

GST-Hsf4b蛋白及GST蛋白,实验室制备保存。新西兰大耳白兔购自河南省实验动物中心。尿素(Urea)购自BIO BASIC INC。Glutathion Seph-arse 4B购自GE Healthcare Bio-Sciences AB。LGluthion Reduced,SCIENTIFIC RESEARCH SRECIAL。弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自SIGMA。辣根过氧化酶标记抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。预染蛋白分子量标准(10―170KD)购自Fermentas。

1.2 方法

“舅翁”一词最早出现于宋代，自此在文献中层出迭见，但词语工具书未见收录，如清人《称谓录》、当下《汉语大词典》和《汉语称谓大词典》等皆不载此词。我们认真梳理古代文献，从相关资料中搜集些许确证，进而发现“舅翁”从古至今主要有四种意思:一是舅爷爷或外祖父;二是舅舅;三是内兄(弟)，即妻子的兄弟;四是女性的公公。惟独没有“岳父”这一义项。

1.2.2 间接ELISA方法检测抗体效价 用抗原稀释液稀释Hsf4b蛋白,使其浓度为1μg/m L,96孔酶标板每孔加入100μL蛋白稀释液包被。以动物免疫前血清作为阴性对照,用磷酸盐缓冲液稀释血清(1∶100 0,1∶2 000,1∶400 0,1∶8 000,1∶1 600……1∶8 192 000),间接ELISA方法检测血清多克隆抗体效价。

1.2.5 Western blot检测多克隆抗体与目的蛋白的结合 制备SDS-PAGE凝胶,取不同剂量的纯化GST-Hsf4b融合蛋白分别加入SDS-PAGE凝胶泳道内,常规蛋白质电泳,转印PVDF膜。将PVDF膜置1∶50稀释的Hsf4b抗体稀释液中,4℃旋转孵育过夜。TBST溶液洗膜。加入稀释好的二抗,室温置摇床孵育1 h。化学发光显色,于暗室中曝光、显影,图像扫描拍照后分析。

1.2.1 血清多克隆抗体制备 新西兰大耳白兔1只,免疫前自耳缘静脉取血作为阴性血清对照。将纯化的GST-Hsf4b蛋白400μg与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后,于动物脊柱旁不同部位皮下多点注射。以初次免疫为0 d计算,第21天、第35天分别以同剂量的GST-Hsf4b蛋白,加弗氏不完全佐剂乳化后,采用同样方法加强免疫2次。第二次加强免疫10 d后,耳缘静脉采血测定血清抗体的效价。抗体效价达到实验要求后,自颈总动脉插管放血,收集血液,置37℃培养箱静置3 h,2 000 rpm离心10 min,取血清分装,于―80℃保存。

1.2.3 多克隆抗体纯化 饱和硫酸铵纯化抗体:取免疫动物血清,用PBS 1∶5倍稀释,4℃缓慢逐滴加入饱和硫酸铵溶液(体积比1∶1),4℃磁力搅拌过夜。4℃、10 000 rpm离心20 min,PBS悬浮沉淀,吸入透析袋内,置PBS溶液中透析4次,每次12 h。

1.2.4 去除血清抗GST抗体 取Glutathion Sepharse 4B 1 m L,加预冷PBS 5 m L,4℃4000 rpm,离心5 min×3次,加PBS 1 m L悬浮beads。加入GST蛋白5 mg,4℃旋转孵育2 h,4 000 rpm,4℃离心5 min。PBS溶液洗5次后,加1 m L PBS混悬。加入饱和硫酸铵纯化的血清50 m L,4℃旋转孵育4 h,离心,收集上清备用。

2.1 多克隆抗体效价

个税改革以后，收益的人群主要就是中等收入人群，那些人低收入人群还是很难在基础方面解决所存在的问题，而且对于高收入人员的影响也是比较小的。在这种情况下，本文分析了现阶段个人所得税所存在的主要问题，而且分析了改革过程中需要面临的困难，最后就是对于所存在的问题提出了相应的解决方案。

用纯化的GST-Hsf4b融合蛋白包被酶标板。间接ELISA方法检测兔抗人GST-Hsf4b多克隆抗体效价,以大于阴性血清A450 nm值4倍计为多克隆抗体效价。结果表明制备的Hsf4b多克隆抗体效价为1∶2 048 000,结果见表1、图1。

2 结果

(2) 观察B时，要经常往其体表滴水以保持湿润，原因是____________；观察C时，发现该物种已具有了呼吸器官[ ]____________；观察D时，发现其体表具有与体内气管相连的[ ]____________，是气体出入的门户。

在常温(293 K)下取质量为m=0.01 g磁性纤维素加入体积10 mL初始浓度C0=50 mg·L-1的pH为7的亚甲基蓝溶液中，振荡吸附，在不同时间间隔内取样测量。由图4可以看出，磁性纤维素对亚甲基蓝的吸附在前10 min时，吸附容量快速增加，10 min后吸附容量缓慢增加且趋于平衡，120 min后吸附容量基本达到平衡，因此选择最佳吸附时间为2 h。

2.2 多克隆抗体与目的蛋白结合

应用Western blotting方法,检测制备的多克隆抗体与GST-Hsf4b蛋白的结合能力。结果发现加样不同剂量的GST-Hsf4b融合蛋白(1～5涌道)与纯化的血清抗体孵育后均有条带显示,且随着Hsf4b蛋白剂量的增加,条带逐渐增粗,而加样GST蛋白的泳道(第6涌道)处无条带显示。提示制备的多克隆抗体与Hsf4b蛋白有良好的结合能力,但不与GST蛋白结合,结果见图2。

3 讨论

晶状体发育是由多个细胞生物学持续、连贯的过程组成,当晶状体形成后,晶状体由外囊,前囊立方上皮,次级纤维细胞,初级纤维细胞等组成。晶状体发育包括赤道区晶状体上皮细胞终生繁殖增生,细胞向后囊迁移,细胞形态和功能向纤维细胞分化、迁移形成次级纤维细胞,次级纤维细胞形态伸长,失去细胞核,细胞内膜性结构细胞器(包括线粒体、内质网、细胞核等)逐渐消失,细胞合成大量晶状体蛋白。热休克转录因子4(Hsf4)是新发现的调控晶状体早期发育的关键转录因子,研究[4-5]发现,应用转基因技术敲除小鼠Hsf4基因,小鼠新生期晶状体发育受阻,出生后3～5 d,小鼠晶状体呈现非透明状白内障。分子水平的研究[6-7]发现,Hsf4调控热休克蛋白25 (Hsp25)、αB-晶体蛋白(αB-crystallin)、γ-晶体蛋白(γ-crystallin)等等晶状体特异调控蛋白的表达,这些蛋白质对维持晶状体的正常结构和功能具有重要的调控作用,但Hsf4和其下游蛋白(Hsp25、αB-晶体蛋白、γ-晶体蛋白)对上皮细胞或纤维细胞的细胞学行为的调控机制尚不太清楚。

图1 ELISA检测多克隆抗体效价

图2 多克隆抗体与目的蛋白结合

为了深入研究Hsf4对晶状体发育的调控机制,实验室构建了Hsf4b表达质粒,经转化BL21菌株, IPTG诱导,表达出了GST-Hsf4b融合蛋白。我们应用纯化的GST-Hsf4b融合蛋白免疫新西兰大耳白兔,应用间接ELISA方法检测血清抗Hsf4b抗体效价,结果显示动物血清Hsf4b抗体效价达到1∶2 048 000,提示动物接种GST-Hsf4b融合蛋白后,体内产生了高滴度的抗Hsf4b抗体。从免疫动物血清中纯化Hsf4b抗体,经免疫印迹检测显示,制备的Hsf4b抗体能够特异结合Hsf4b蛋白,且不与GST蛋白结合,结果表明,我们制备的Hsf4b多克隆抗体能够特异识别Hsf4b,可以用于后续的Hsf4b调控晶状体发育机制研究。

[1]Bu L,Jin Y,Shi Y,et al.Mutant DNA-binding domain of HSF4 is associated with autosomal dominant lamellar and Marner cataract[J].Nat Genet,2002,31(3):276―278.

[2]张军,马增翼,李淑莲,等.HSF4B通过上调Rho A和Rac1促进晶状体上皮细胞迁移[J].中国生物化学与分子生物学报,2013,29(4):377―382.

[3]Min J N,Zhang Y,Moskophidis D,et al.Unique contribution of heat shock transcription factor 4 in ocular lens development and fiber cell differentiation[J].Genesis,2004, 40(4):205―217.

[4]Shi X,Cui B,Wang Z,et al.Removal of Hsf4 leads to cataract development in mice through down-regulation of gamma SCRYSTALLIN and Bfsp expression[J].BMC Mol Biol,2009,19(10):10.

[5]Mou L,Xu J Y,Li W,et al.Identification of vimentin as a novel target of HSF4 in lens development and cataract by proteomic analysis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2010, 51(1):396―404.

[6]Kaija H,Pakanen L,Kortelainen M L,et al.HSF4 promotes G1/S arrest in human lens epithelial cells by stabilizing p53[J].Biochim Biophys Acta,2015,1853(8): 1808―1817.

[7]Gangalum R K,Jing Z,Bhat A M,et al.Expression of the HSF4 DNA binding domain-EGFP hybrid gene recreates early childhood lamellar cataract in transgenic mice[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2014,55(11):7227―7240.

[责任编辑 李武营]

Purification and preparation of Hsf4b polyclonal antibody

ZHANG Yuanyuan，YANG Yawen，DONG Guangyao，WU Yifan，LI Pengfei，LI Shulian
（Antibody drug lɑb of Henɑn Province，Medicɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveTo prepare Hsf4b polyclonal antibody.MethodsThe rabbit was immunized by the purified fusion protein，and produced serum with anti-Hsf4b antibody.The titer of polyclonal antibody was detected by ELISA，The anti-Hsf4b polyclonal antibody was purified by saturated ammonium sulfate precipitation，and its combining specificity with Hsf4b protein was further identified by Western blot.ResultsThe polyclonal antibody purified by saturated ammonium sulfate precipitation was able to combine specially with Hsf4b protein.Conclusionthe anti-Hsf4b polyclonal antibodies with high titer and specificity are successfully prepared，These antibodies provide an useful experimental tool to research the biological function of the Hsf4b protein.

heat shock transcriptionfactor 4；fusion protein；polyclonal antibody；ELISA

R785.1

A

1672―7606(2015)04―0259―03

2015-09-30

河南大学大学生创新性实验校级项目(No.14NA021)

张原源(1994―),女,河南开封人,河南大学临床医学2012级本科生。

*通讯作者:李淑莲(1965―),女,河南开封人,教授,硕士生导师,从事生物免疫的教学与研究工作。