瑞舒伐他汀对大鼠缺血心肌嗜铬粒蛋白A和MR-proADM表达的影响

孙慎杰，吴小鹏，宋恒良，李贵琦，张 娟，万大国，段温泉，朱 沙

(1.郑州大学第二附属医院心内科 450014；2.郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 450001)

论著·基础研究

瑞舒伐他汀对大鼠缺血心肌嗜铬粒蛋白A和MR-proADM表达的影响

孙慎杰1，吴小鹏1，宋恒良1，李贵琦1，张 娟1，万大国1，段温泉1，朱 沙2

(1.郑州大学第二附属医院心内科 450014；2.郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 450001)

目的 研究瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠缺血心肌嗜铬粒蛋白A(CGA)和肾上腺髓质素原中间片段(MR-proADM)表达的影响。方法采用冠状动脉结扎术建立30只急性心肌梗死大鼠模型，分成对照组(n=15)和治疗组(n=15)，以15只正常大鼠作为空白组，其中治疗组接受瑞舒伐他汀治疗。分别在手术治疗后3、7 d和14 d取5只大鼠的心肌组织。采用荧光定量PCR检测组织内CGA和MR-proADM mRNA转录量，采用Western blot检测组织内CGA和MR-proADM的表达量。结果治疗后第7天和第14天治疗组CGA和MR-proADM mRNA和蛋白表达量与空白组差异无统计学意义(P>0.05)，对照组CGA和MR-proADM mRNA和蛋白表达量均显著高于治疗组和空白组(P<0.05)。结论瑞舒伐他汀可有效降低急性心肌梗死大鼠心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA转录和蛋白表达。

心肌梗死；嗜铬粒蛋白A；肾上腺髓质素原中间片段；瑞舒伐他汀

心肌梗死是临床死亡率较高的心血管疾病，瑞舒伐他汀主要用于治疗冠心病[1]、心绞痛[2]，对心肌梗死的治疗也有报道[3]。为了明确瑞舒伐他汀治疗心肌梗死的临床效果，本文拟分析瑞舒伐他汀是否具有通过改变心肌梗死缺血心肌组织内嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CGA)和肾上腺髓质素原中间片段(MR-proADM)表达的作用，以初步探讨瑞舒伐他汀新的药用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康雄性SD大鼠15只，鼠龄15～16月，分笼饲养。大鼠体质量(614.9±46.8)g，体温(38.1±0.6)℃，呼吸频率每分钟(71.4±4.8)次，心率每分钟(391.1±29.4)次，收缩压(134.8±17.5)mm Hg，舒张压(91.7±12.0)mm Hg，平均动脉压(106.0±12.6)mm Hg。

1.2 模型建立 10%水合氯醛0.35 mL/100 g经腹腔注射麻醉，然后将大鼠卧于手术台上，沿颈部中线切开皮肤，分离组织暴露气管，用7号注射针头作为插管以45°斜进针从甲状软骨下缘轻轻水平插入约0.7～1.5 cm 斜面朝上。固定好,气管插管，呼吸比为1∶2，呼吸频率每分钟90次,潮气量14 mL/kg。关闭呼吸机，四肢接心电图机记录术前心电图以验证是否具有先天性变异。完毕打开呼吸机。心前区域剃毛,在心脏搏动最明显处,第三肋间隙水平开胸,皮肤切口约1.5～2.0 cm,逐层钝性分离肌肉至胸膜。剪开胸膜,用眼科开睑器撑开肋间肌切口,以无菌棉球向下压迫左肺以保护肺脏剪开心包,用无菌棉拭子推开左心耳。在左心耳下距主动脉根部2～3 mm处,用6-0线穿过一小束心肌,并结扎。(1)结扎后左室壁变苍白,并出现室壁运动减弱。(2)术中结扎成功标识:心电监护见Ⅱ导联大鼠于结扎冠状动脉后QRS波峰降低，J点上移，ST段明显抬高，证明心肌缺血存在心肌梗死。然后加大通气量,充分使肺复张,并清理胸腔。逐层关胸,断开呼吸机,清理呼吸道(拔出气管插管后应注意将大鼠舌头外提，防止舌根后坠出现缺氧窒息)并观察大鼠呼吸，以浅快呼吸，频率以每分钟30～40次为宜，术后单笼饲养。

1.3 分组和治疗 30只大鼠模型分成对照组(n=15)和治疗组(n=15)，以15只正常大鼠作为空白组。对照组采用生理盐水灌胃1周。治疗组通过灌胃，按照4 mg·kg-1·d-1瑞舒伐他汀进行治疗，共治疗1周。空白组为健康大鼠，不进行任何处理。分别在手术治疗后3、7 d和14 d取5只大鼠心肌组织。

1.4 荧光定量PCR 取出不同时间(通氧前，缺氧8 h，通氧3 h，通氧6 h和通氧9 h)各组3个孔的细胞，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400×g或1 700 rpm离心5 min，去上清液，收集的细胞。使用TRIzol Reagent试剂盒抽提细胞的总mRNA,并用DEPC水定量至5 μg/μL。使用PrimeScript®One Step RT-PCR Kit将总mRNA拟转录成cDNA，并定量。特异性引物为：GAPDH-F 5′-TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC-3′,GAPDH-R 5′-GCT CCG GAA GAT GGT GAT GG-3′;CGA F 5′-TGG TTC AGT GCT TCG GCC AC-3′;CGA R 5′-CCA GCA GTG AGG TTT CCA TG-3′；MR-proADM F：5′-GCC TTT CCT ACT ACC ATT CCC-3′，MR-proADM R：5′-CATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3′;均为上海生工合成。以GAPDH为内参，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒和伯乐IQ5 PCR系统扩增cDNA中的组织因子基因片段和GAPDH基因片段，反应条件设置为：95 ℃变性5 min，94 ℃变性30 s,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,30个循环，72 ℃延伸10 min。计算每个样品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法计算每个样品中TF的mRNA转录倍数。

1.5 Western blot 取出不同时间(治疗后3、7 d和14 d)缺血心肌组织，按照体积重量比(V/W)=5加入一定量的缓冲溶液(50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,1% Nonidet P-40,0.5% deoxycholic acid,0.1%SDS,5 mM EDTA,2 mM PMSF,20 g/mL aprotinin,20 g/mL leupeptin,10 g/mL pepstanin A和150 mM benzamidine)，然后用组织破碎仪破碎组织，破碎后12 000 rpm离心20 min后取上清液进行电泳。使用5%浓缩胶和15%分离胶进行电泳分离，并使用电转将蛋白转至PVDF膜上。10%牛奶封闭PVDF膜1 h，37 ℃孵育一抗1 h[CGA抗体(ab85554)，Anti-proANP(ab126881)]，PBST清洗3次，每次5 min，然后用37 ℃孵育二抗稀释液，并用PBST清洗3次，每次5 min。最后用ECL+plusTMWestern blotting system kit (Amersham,美国)配置显光液，然后使用3490 Photo Gel Imaging Systems (Epson,日本)拍照并记录，并用Image Pro Plus软件分析每个蛋白与GAPDH的相对量。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料用率表示，采用卡方检验，计量资料用采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR结果 应用荧光定量PCR检测各组大鼠心肌组织内CGA(图1a)和MR-proADM (图1b)mRNA转录量，结果见图1。治疗后第7天和第14天治疗组CGA和MR-proADM mRNA与空白组差异无统计学意义，对照组CGA和MR-proADM mRNA均显著高于治疗组和空白组。说明心肌梗死大鼠心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA转录量会升高，瑞舒伐他汀可有效降低心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA转录量。

图1 CGA和MR-proADM荧光定量PCR结果

2.2 Western blot结果 应用Western blot检测各组大鼠心肌组织内CGA(图2a)和MR-proADM (图2b)蛋白表达量，结果见图2。治疗后第7天和第14天治疗组CGA和MR-proADM蛋白表达量与空白组差异无统计学意义，对照组CGA和MR-proADM蛋白表达量均显著高于治疗组和空白组。说明心肌梗死大鼠心肌组织内Chromogranin A和MR-proADM蛋白表达量会升高，瑞舒伐他汀可有效降低心肌组织内Chromogranin A和MR-proADM mRNA蛋白表达量。

图2 CGA和MR-proADM 蛋白表达量

3 讨 论

本文通过冠状动脉结扎术作急性心肌梗死大鼠模型，分析瑞舒伐他汀对心肌梗死大鼠缺血心肌组织内CGA和MR-proADM表达的影响。结果发现，治疗后第7天和第14天治疗组CGA和MR-proADM mRNA和蛋白表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，对照组CGA和MR-proADM mRNA和蛋白表达量均显著高于治疗组和空白组(P<0.05)。因此，心肌梗死大鼠心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA和蛋白表达量会升高，瑞舒伐他汀可有效降低心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA转录和蛋白表达。

所以选择研究心肌组织CGA和MR-proADM与瑞舒伐他汀之间的关系，一方面是有大量研究报道CGA和MR-proADM与心血管疾病相关，另一方面可初步探讨瑞舒伐他汀除改变机体低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)的比例来发挥治疗心血管疾病的作用外的性的药理机制。CGA是分布于神经内分泌系统的一类神经肽类物质[4]，在高尔基网膜上选择性调节靶肽激素和神经递质聚集，并促进高尔基网的通透性，并参与Ca2+及儿茶酚胺代谢，已经报道与心血管疾病有相关性[5-6]。MR-proADM是一种急性心肌梗死患者预后标志分子，该分支的检测可以有效地评价心肌梗死进展及治疗后预后情况[7-8]。瑞舒伐他汀目前已经应用于临床，主要适应证为冠心病[9]、高胆固醇血症[10]、血脂异常[11-14]等心血管疾病，该药物是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂，其药理作用是通过增加肝细胞表面LDL受体而促进肝脏对LDL的吸收，并且通过抑制HMG-CoA还原酶而抑制VLDL的合成，进行改变机体LDL和VLDL的比例来发挥治疗心血管疾病的作用。本文可初步得出瑞舒伐他汀可用于治疗心肌梗死，并且可能是通过降低心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA转录和蛋白表达来发挥作用。

虽然本文已经明确了瑞舒伐他汀可有效降低心肌组织内CGA和MR-proADM mRNA转录和蛋白表达，但瑞舒伐他汀与CGA和MR-proADM的直接相关性还不能下结论，需要通过在细胞水平进一步去验证，并且通过过表达CGA和MR-proADM来评价是否可逆转瑞舒伐他汀的作用，以及明确CGA和MR-proADM相互关系，以进一步深入探讨瑞舒伐他汀治疗心肌梗死的新的药理机制。

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Effect of rosuvastatin on expression of chromogranin A and original middle segment of MR-proADM in ischemia myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

SunShenjie1，WuXiaopeng1，SongHengliang1，LiGuiqi1，ZhangJuan1，WanDaguo1，DuanWenquan1,ZhuSha2

(1.DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450014，China;2.TeachingandResearchSectionofMicrobiologyandImmunology,CollegeofBasicMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450001，China)

Objective To analyze the effect of rosuvastatin on the expression of chromogranin A and the original middle segment of MR-proADM in ischemia myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction,and to investigate its mechanism.Methods The rat model with acute myocardial infarction was established with the coronary artery ligation.30 model rats were divided into control group (n=15) and the treatment group (n=15),with 15 normal rats as the blank group.The treatment group received the rosuvastatin treatment.On 3,7,14 d after treatment,the myocardial tissues of 5 rats were taken.The fluorescence quantitative PCR was performed to detect chromogranin A and adrenomedullin original middle fragment of MR-proADM mRNA transcription,and Western blot was used to measure the expression of chromogranin A and adrenomedullin original middle segment of MR-proADM.Results On 7,14 d after treatmenr,CGA and MR-proADM mRNA and protein expression had no statistically significant difference between the treatment group and the blank group (P>0.05),CGA and MR-proADM mRNA and protein expression of the control group were significantly higher than those of the treatment group and the blank group (P<0.05).Conclusion Rrosuvastatin can effectively decrease the expression of chromogranin A，MR-proADM mRNA transcription and protein expression in the myocardial infarcted rats.

myocardial infarction;chromogranin A;proadrenomedullin intermediate fragments；rosuvastatin

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.13.005

国家自然科学基金资助项目(81041102)。

孙慎杰(1979-)，硕士，主治医师，主要从事心血管疾病的介入治疗。

R542.2+2

A

1671-8348(2015)13-1741-03

2014-12-08

2015-02-16)