利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除AcMNPV lef-10基因

白 玉，许晓东

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除
AcMNPVlef-10基因

白 玉，许晓东

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体，为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】 利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPVlef-10进行点突变，由于lef-10和必需基因vp1054有重叠，所以在敲除lef-10时只能通过引进点突变使lef-10失活，避免影响vp1054的正常表达。首先，构建rpsL-AMP筛选盒，然后在野生型AcBacmid中引进点突变(方法是通过2次Red/ET重组：第1次重组在野生型AcBacmidlef-10中引进rpsL-AMP抗性筛选标记，形成一次重组Bacmid，第2次重组是在一次重组Bacmid中引进含点突变的lef-10片段)，再利用链霉素反向筛选去除rpsL-AMP抗性筛选标记，同时引入相应的点突变。将从lef-10基因点突变重组菌中提取得到的AcBacmid与质粒pTriEx1.1和pTriEx-innateP-lef10分别共转染草地贪夜蛾Sf9细胞，同时用野生型AcBacmid与质粒pTriEx1.1共转染Sf9细胞作为对照，显微镜下观察病毒的复制情况，确定lef-10基因是否为AcMNPV的必需基因。【结果】 通过对重组Bacmid的PCR鉴定和点突变序列的测定，证明AcMNPVlef-10基因已经发生点突变；通过共转染试验发现，随着转染时间的延长，lef-10补回型病毒和野生型病毒一样，均能在Sf9细胞中复制产生具有感染性的子代病毒粒子BV，从而对邻近细胞造成二次感染，使得细胞死亡，且lef-10补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致；而由于lef-10缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子，所以在被lef-10缺失型重组病毒转染的细胞中，细胞数目不会随着转染时间的增加而发生明显改变。【结论】 利用Red/ET重组系统结合rpsL反向筛选系统可以在AcMNPVlef-10基因中引入点突变，且lef-10是杆状病毒生活周期中的一个必需基因，其缺失会影响杆状病毒的复制。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)；lef-10；Red/ET重组系统；rpsL反向筛选系统；基因敲除

杆状病毒是一类专性寄生于昆虫和某些甲壳类无脊椎动物的病原微生物，根据其包涵体的形态可分为2个属，即核多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和颗粒体病毒属(Granulovirus，GV)[1]。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是昆虫杆状病毒科核多角体病毒属的代表成员，是一类在宿主细胞核内复制的DNA病毒。其基因组长134 kb，共有154个开放阅读框。AcMNPV基因的表达可分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。

早期基因主要为病毒基因组DNA复制和晚期基因表达提供必需的蛋白因子。晚期基因的表达依赖于病毒基因组DNA的复制，并通过一种病毒编码或病毒改造过的RNA聚合酶转录，同时需要一类蛋白因子调控其表达，即晚期表达因子(Late expression factor，lef)。

瞬时表达试验证明，AcMNPV中已鉴定的19种lef基因[2-3]中有11种与病毒DNA的复制有关，即lef-1[4]、lef-2[5]、lef-3[6-7]、lef-7[8]、lef-11[9]、p143[7]、dnapol[10]、ie1[11]、ie2[12]和p35[13]，另外lef-10基因也可影响病毒DNA的复制水平[14]。其中lef-1、lef-2、lef-3、p143、lef-11、dnapol和ie1是DNA复制的必需基因，lef-10、lef-7、ie2和p35是促进DNA复制的基因。p35对DNA复制的促进作用与其抗细胞凋亡功能有关。lef-1和lef-2既是DNA复制的必需基因，也是调控晚期基因表达的基因。其他参与晚期基因表达调控的基因有lef-4[15]、lef-5[16]、lef-6[17]、lef-8[15]、lef-9[15]、lef-10[7,12]、lef-12[18]、39k[19]和p47[15]，但除lef-10之外，这些基因均不参与病毒基因组DNA的复制。

在19个晚期表达因子中，目前关于AcMNPVlef-10基因功能的研究还比较少。lef-10基因位于AcMNPV基因组33.8～35.9图谱单位，并且呈顺时针方向排列，其编码一个由78个氨基酸组成的小蛋白，分子质量为8.7 ku，等电点为3.6，是迄今鉴定的分子质量最小的晚期表达基因的产物。lef-10的同源基因在所有的GroupⅠ和大部分GroupⅡ杆状病毒中都存在[2]。瞬时表达试验证明，lef-10与晚期和极晚期基因表达有关，但与早期基因表达无关[7]。lef-10也是晚期基因有效表达的必需基因[7]。当用家蚕核多角体病毒(BmNPV)lef-10缺失突变体转染BmNPV细胞时，检测到子代病毒滴度为零，病毒基因组复制水平下降，基因转录水平也显著下降，同时也未检测到早期基因lef-3的表达，这些结果表明，BmNPVlef-10对于病毒基因组DNA的复制及晚期基因的转录具有重要作用，还会影响早期基因的表达水平[14]。

虽然研究证实lef-10基因在BmNPV的生活周期中是必需基因，但并不表明在AcMNPV中也是必需的，如Ac16是AcMNPV的结构蛋白，对于出芽型病毒(BV)和包涵体病毒(ODV)的形成具有重要作用，但却不是BmNPV的结构蛋白，其缺失不会影响BmNPV中BV和ODV的形成[20-21]。Ac31[22-23]和Ac68[24-25]是BmMNPV复制所必需的基因，但这2个基因的缺失却不会影响AcMNPV在昆虫细胞中的复制。Ac74、Ac88、Ac102和Ac129/He118与AcMNPV ODV的形成有关，却与棉铃虫核多角体病毒(HearNPV) ODV的形成无关[21,26]。

本试验用到的反向筛选标记基因为rpsL-AMP，这段基因中含有氨苄青霉素抗性基因和链霉素抗性抑制基因，将此基因导入Bacmid中并转化到特定的大肠杆菌株系(有链霉素抗性的HS996、DH10B等株系)后，会使得大肠杆菌获得氨苄青霉素抗性并抑制其本身的链霉素抗性，而用外源基因通过重组的方法将此标记基因替换后，菌株的链霉素抗性恢复而氨苄青霉素抗性消失，从而能方便地在大肠杆菌中获得lef-10点突变的重组杆状病毒质粒。本试验利用链霉素反向筛选方法，在lef-10基因中引入点突变，尽量避免对lef-10临近基因上下游调控序列的扰动，首次利用Red系统结合rpsL反向筛选成功敲除了AcMNPVlef-10基因，以期为进一步研究AcMNPVlef-10基因的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和细胞

大肠杆菌Top10(EscherichiacoliTop10)、大肠杆菌HS996(EscherichiacoliHS996)(含AcMNPV Bacmid DNA和Red/ET 重组质粒 pRedET)、大肠杆菌BL21(DE3)、载体pTriEx1.1和Sf9细胞，皆由西北农林科技大学生命科学学院分子病毒学实验室保存；AcMNPV Bacmid来源于 University of Reading，Prof.Ian Jones实验室。

1.2 主要试剂

高载量PCR片段纯化试剂盒和柱式DNAback试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶BspHⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ及T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司，DL5000 DNA Marker购自Vazyme公司，酵母浸粉和蛋白胨均购自北京奥博星生物技术有限公司，Fugene HD转染试剂购自Roche公司，胎牛血清购自Thermo Scientific HyClone公司。

1.3 引物设计与合成

研究用到的引物均用Primer Premier 5软件设计(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 rpsL-AMP筛选盒的构建

本试验用到的反向筛选标记基因为rpsL-AMP，该基因是从rpsL-AMP筛选盒中通过PCR扩增得到的，所以首先需要构建1个rpsL-AMP筛选盒，构建过程(图1)如下。

1.4.1rpsL基因的PCR扩增rpsL基因是通过2次PCR反应得到的，第2次PCR反应的目的是为了在rpsL基因的3′末端引进一个SD序列，使未来构建的筛选盒中的AMP基因可以利用此序列进行翻译。具体做法如下：

以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，用引物rpsL-UP/rpsL-Down-Amp进行PCR扩增，扩增体系为：大肠杆菌BL21(DE3)单菌落用接种针挑一下作为模板， 10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物rpsL-UP 1 μL，10 μmol/L下游引物rpsL-Down-Amp 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 7 min， 最后16 ℃保存。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用柱式DNAback试剂盒纯化，再以纯化后的片段为模板，用引物rpsL-UP/rpsL-Down-Amp-1进行PCR扩增，扩增体系为：模板rpsL1 0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物rpsL-UP 1 μL，10 μmol/L下游引物rpsL-Down-Amp-1 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 7 min,最后16 ℃保存。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用高载量PCR片段纯化试剂盒纯化，-20 ℃保存。

图1 rpsL-AMP筛选盒的构建过程

1.4.2 pTriEx-rpsL质粒的构建 用限制性内切酶BspHⅠ和XhoⅠ对上述第2次扩增的PCR回收产物进行双酶切，然后用PCR产物纯化试剂盒回收；NcoⅠ和XhoⅠ双酶切pTriEx1.1质粒，切胶回收酶切后的大片段，然后与酶切回收的PCR产物在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜。然后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养平板上，37 ℃培养16～20 h，挑单菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落接种至含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min过夜摇菌，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，并对其用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性克隆的重组质粒送往上海生工生物工程有限公司测序，构建正确的重组质粒命名为pTriEx-rpsL。

1.4.3rpsL-AMP片段的PCR扩增 以pTriEx-rpsL质粒为模板，用引物rpsL-AMP-UPNew/rpsL-Down-Amp-1进行PCR扩增，该扩增产物包含了ColEI的复制起始位点。扩增体系如下：pTriEx-rpsL质粒0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物rpsL-AMP-UPNew 1 μL，10 μmol/L下游引物rpsL-Down-Amp-1 1 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 210 s，35个循环；72 ℃ 10 min, 最后16 ℃保存。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用柱式DNAback试剂盒纯化，-20 ℃保存。

1.4.4 prpsL-AMP质粒的构建 用限制性内切酶BspHⅠ对1.4.3中PCR回收产物进行部分单酶切，然后用柱式DNAback试剂盒回收大片段，将回收的酶切产物在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜，然后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养平板上，37 ℃培养16～20 h，挑单菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落接种至含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min过夜摇菌，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，并对其用BspHⅠ进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性克隆的重组质粒送往上海生工生物工程有限公司测序，构建正确的重组质粒命名为prpsL-AMP。

1.5 lef-10-KO-Bacmid的构建

1.5.1 一次同源重组线性片段lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR的制备 通过对lef-10进行保守区间分析以及参考lef-10上下游基因的转录分析，在lef-10基因起始密码子ATG下游12 bp处插入rpsL-AMP片段，造成插入突变以破坏lef-10的结构。但该片段的插入可能会影响lef-10下游基因vp1054的表达，所以需要利用rpsL反向筛选敲除策略进行二次重组，用含lef-10点突变的Linker DNA片段将rpsL-AMP替换出去，造成lef-10点突变，以最大限度地破坏lef-10的结构而又不影响其下游基因的表达。

为了通过ET重组完成对lef-10基因的插入缺失，参照AcMNPV基因组全序列[27]和已构建好的prpsL-AMP质粒序列，用Primer Premier 5软件设计特异性扩增引物对10rpsLF/10AMPR和lef10MF/lef10MR(表1)。10rpsLF/10AMPR引物对分别由AMP基因的引物区域和rpsL基因的引物区域组成。lef10MF/lef10MR引物对均由两部分组成，分别是lef-10的同源臂区域和AMP基因的引物区域以及lef-10的同源臂区域和rpsL基因的引物区域。lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR的同源臂区域长50 bp，为lef-10基因中被插入区域上下游50 bp的序列。PCR反应以prpsL-AMP质粒为模板，进行两轮扩增，扩增产物即为lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR。具体做法如下：

以prpsL-AMP质粒为模板，用10rpsLF/10AMPR进行第一轮PCR扩增，扩增体系如下：prpsL-AMP质粒0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物10rpsLF 1 μL，10 μmol/L下游引物10AMPR 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 80 s，30个循环；72 ℃ 10 min, 最后16 ℃保存。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用柱式DNAback试剂盒纯化，再以纯化后的片段为模板，用引物lef10MF/lef10MR进行第二轮PCR扩增，扩增体系为：模板 0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物lef10MF 1 μL，10 μmol/L下游引物lef10MR 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 7 min,最后16 ℃保存。取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，其余的加入5 μL 3 mol/L NaAc(pH 7.0)和150 μL 体积分数100% 乙醇进行沉淀，于-20 ℃放置30 min， 12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL体积分数70%乙醇洗涤，12 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀在超净台上风干5～10 min，加入5 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解，-20 ℃保存。

1.5.2 一次重组Bacmid的构建 挑取EscherichiacoliHS996 (含AcMNPV Bacmid DNA和Red/ET 重组质粒 pRedET)单克隆，接种到含卡那霉素(15 μg/mL)和四环素(3 μg/mL)的LB液体培养基中，30 ℃培养过夜。转接过夜培养的菌液，培养至OD600为0.2～0.3，加入L-阿拉伯糖至终质量浓度 3～4 g/L后于37 ℃培养0.75～1 h，按Counter-Selection BAC Modification Kit的方法制备电转化感受态细胞。将1 μL乙醇沉淀回收的lef10MF-rpsL-AMP-lefMR线性化片段和EscherichiacoliHS996感受态细胞混合后，转入电击杯中，用SCIENTZ-2B基因导入仪进行电转化。电击参数设置为电压 1 350 V，电容5 μF，电阻600 Ω。电击后立刻加入1 mL的不含抗生素的LB液体培养基，30 ℃复苏培养1 h，然后涂布于含氨苄青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四环素(3 μg/mL)的LB固体平板上，30 ℃培养18～24 h。

1.5.3 一次重组Bacmid的PCR鉴定 随机挑取抗氨苄青霉素、卡那霉素和四环素的单菌落，用不同的引物组合进行PCR扩增，以验证lef-10基因是否发生插入突变。所用的扩增引物分别为lef-10基因的上、下游引物lef10-promoter-F和lef10-39R(表1)及rpsL-AMP基因内部引物对rpsL-AMP-UPNew和10AMPR。不同组合分别为lef10-promoter-F/10AMPR和rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R。所有的PCR反应都用野生型病毒Bacmid作为对照。

1.5.4 二次同源重组线性片段lef10MF-Linker-lef10MR的制备 参照AcMNPV基因组全序列，用Primer Premier5软件设计特异性Linker DNA引物10MlinkF和10MlinkR(表1)，引物中的划线部分为引进的点突变，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

分别取10MlinkF和10MlinkR各20 μL混合均匀，在PCR仪上进行高温变性-低温复性反应：95 ℃ 40 s，16 ℃ 30 s，使Linker DNA成为双链。以双链Linker DNA为模板，用引物lef10MF/lef10MR进行PCR扩增，扩增体系为：模板 0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物lef10MF 1 μL，10 μmol/L下游引物lef10MR 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s，30个循环；72 ℃ 7 min, 最后16 ℃保存。取5 μL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，其余的加入5 μL 3 mol/L NaAc(pH 7.0)和150 μL体积分数 100% 乙醇进行沉淀，于-20 ℃ 放置30 min, 12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL体积分数70%乙醇洗涤，12 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀在超净工作台上风干5～10 min，加入5 μL 10 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解，-20 ℃保存。

1.5.5 二次重组Bacmid的构建 挑取一次重组的EscherichiacoliHS996单克隆接种到含氨苄青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四环素(3 μg/mL)的LB液体培养基中，30 ℃培养过夜。转接过夜培养的菌液，培养至OD600为0.2～0.3，加入L-阿拉伯糖至终质量浓度3～4 g/L后于37 ℃培养 45～60 min，按Counter-Selection BAC Modification Kit的方法制备电转化感受态细胞。将1 μL乙醇沉淀回收的lef10MF-Linker-lef10MR线性化片段和一次重组的EscherichiacoliHS996感受态细胞混合后，转入电击杯中，用SCIENTZ-2B基因导入仪进行电转化。电击参数设置为电压1 350 V，电容5 μF，电阻600 Ω。电击后立刻加入1 mL不含抗生素的LB液体培养基，于37 ℃复苏培养1 h,然后涂布于含链霉素(50 μg/mL)和卡那霉素(15 μg/mL)的LB固体平板上，37 ℃培养18～24 h。

1.5.6 二次重组Bacmid的PCR鉴定 随机挑取抗链霉素、卡那霉素和四环素的单菌落，用不同的引物组合进行PCR扩增，以验证lef-10基因是否发生点突变。所用的扩增引物分别为lef-10基因的上、下游引物lef10-promoter-F和lef10-39R及rpsL-AMP基因的上游引物rpsL-AMP-UPNew。不同组合分别为lef10-promoter-F/lef10-39R和rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R。所有的PCR反应都用野生型病毒Bacmid作为对照。

1.6 lef-10-KO-Bacmid转染草地贪夜蛾Sf9细胞

为构建野生型、敲除型和恢复型重组病毒，提取二次重组病毒Bacmid DNA，用pTriEx1.1与野生型AcMNPV Bacmid(对照)、pTriEx1.1与二次重组病毒Bacmid及pTriEx-innateP-lef10与二次重组病毒Bacmid 分别共转染Sf9细胞，形成重组病毒的基因组可以在宿主细胞中进行表达。转染步骤为：取0.5 mL离心管，向其中加入100 μL无菌水、5 μL构建好的质粒和5 μL线性化Bacmid，混匀后加入5 μL转染试剂，再充分混匀，静置10～30 min后均匀加入到铺好的Sf9细胞中。转染4 d后收集上清病毒，然后取100 μL病毒重新感染Sf9细胞，3 d后，置于普通光学显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 rpsL-AMP筛选盒的构建

2.1.1rpsL基因的PCR扩增及重组质粒pTriEx-rpsL的双酶切鉴定 以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，通过2次PCR扩增rpsL基因，得到513 bp的特异性片段，大小与预期结果吻合(图2-A)。构建的重组质粒pTriEx-rpsL经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，得到约723 bp的片段(图2-B)，与预期片段大小相同，表明载体构建正确。

2.1.2rpsL-AMP片段的 PCR扩增及重组质粒prpsL-AMP的单酶切鉴定 以pTriEx-rpsL质粒为模板，通过PCR扩增rpsL-AMP片段，得到 3 322 bp的特异性片段，大小与预期结果吻合(图3-A)。构建的重组质粒prpsL-AMP经BspHⅠ单酶切后，得到2 645和677 bp的2条片段(图3-B)，与预期片段大小相同，表明载体构建正确。

2.2 lef-10-KO-Bacmid的构建

2.2.1 一次同源重组线性片段lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR的鉴定 以prpsL-AMP质粒为模板，通过两轮PCR扩增lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR片段，琼脂糖凝胶电泳后得到1 486 bp的特异性片段，大小与预期结果吻合(图4)。该片段即为一次重组所需的线性化片段。

图2 rpsL基因的PCR扩增结果(A)及重组质粒pTriEx-rpsL的双酶切鉴定(B)M.DNA Marker;1.rpsL基因的PCR扩增产物；2.pTriEx-rpsL的双酶切产物

图3 rpsL-AMP基因的PCR扩增结果(A)及重组质粒prpsL-AMP的单酶切鉴定结果(B)M.DNA Marker;1.rpsL-AMP基因的PCR扩增产物；2.prpsL-AMP的单酶切产物

2.2.2 一次重组Bacmid的构建 将回收的线性片段电转化L-阿拉伯糖诱导后的E.coliHS996，在重组酶作用下，线性片段与lef-10基因发生同源重组，在含氨苄青霉素、卡那霉素和四环素的固体平板上获得了多个重组转化子。

2.2.3 一次重组Bacmid的PCR鉴定 随机挑取单克隆，用不同组合引物进行交叉PCR鉴定。不同引物组合分别为lef10-promoter-F/10AMPR和rpsl-AMP-UPNew/lef10-39R。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测得到的目的片段(图5)，结果与预期结果大小相同。表明lef-10基因中已经插入外源线性DNA片段rpsL-AMP，一次重组病毒构建正确。

2.2.4 二次同源重组线性片段lef10MF-Linker-lef10MR的制备 以双链Linker DNA为模板，通过PCR扩增lef10MF-Linker-lef10MR片段，琼脂糖凝胶电泳后得到118 bp的特异性片段，大小与预期结果吻合(图6)，该片段即为二次重组所需的线性化片段。

2.2.5 二次重组Bacmid的构建 将回收的线性片段电转化L-阿拉伯糖诱导后的一次重组大肠杆菌HS996，在重组酶作用下，线性片段与lef-10基因发生同源重组，在含链霉素、卡那霉素的固体平板上获得了多个重组转化子。

2.2.6 二次重组Bacmid的PCR鉴定 随机挑取单克隆，用不同组合引物进行交叉PCR鉴定。不同组合引物分别为lef10-promoter-F/lef10-39R和rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R。PCR产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测得到的目的片段(图7)，结果与预期大小相同，表明lef-10基因中可能已经引入点突变。对用引物对lef10-promoter-F/lef10-39R扩增的PCR产物测序，结果显示lef-10基因中确实已引入点突变(图8)，表明二次重组病毒构建正确。

图4 lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR片段的PCR扩增结果 M.DNA Marker;1，2.lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR 片段的PCR扩增产物

图5 一次重组病毒的PCR鉴定 M.DNA Marker;1,2,5和6是用引物对lef10-promoter-F/10AMPR进行PCR扩增的产物；3,4,7和8是用引物对rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R 进行PCR扩增的产物，图谱底部的小片段是引物二聚体。泳道1,3,5和7使用一次重组病毒作为模板；泳道2,4,6和8使用wtBacmid DNA作为模板

图6 lef10MF-Linker-lef10MR片段的PCR扩增结果 M.DNA Marker;1，2.lef10MF-Linker-lef10MR 片段的PCR扩增产物

图7 二次重组病毒的PCR鉴定M.DNA Marker;2,3,4和6是用引物对lef10-promoter-F/ lef10-39R进行PCR扩增的产物；1和5是用引物对 rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R进行PCR扩增的产物。泳道1-4使用重组病毒作为模板；泳道5-6使用wtBacmid DNA作为模板

图8 lef-10基因部分序列的测序结果

2.3 lef-10-KO-Bacmid转染草地贪夜蛾Sf9细胞

用pTriEx1.1与野生型AcMNPV Bacmid、pTriEx1.1与重组AcMNPV Bacmid及pTriEx-innateP-lef10与重组AcMNPV Bacmid 分别共转染Sf9细胞，形成重组病毒的基因组可以在宿主细胞中进行表达，从而使得细胞大量死亡。在普通光学显微镜下观察Sf9细胞的生长情况(图9)可以发现，随着转染时间的延长，被lef-10补回型重组病毒和野生型病毒转染的细胞出现大量死亡，死亡的细胞不再贴壁生长，而是游离悬浮于细胞培养液中，表明lef-10补回型病毒与野生型病毒一样，均能在Sf9细胞中复制产生具有感染性的子代病毒粒子BV，从而对邻近细胞造成二次感染,使得细胞死亡；而在被lef-10敲除型重组病毒转染的细胞中，细胞数目不会随着转染时间的增加而发生明显改变，细胞能够密集地贴壁生长。因此可以初步判断，lef-10基因的缺失会影响病毒的复制，进一步说明lef-10基因点突变型重组病毒构建成功。

图9 野生型病毒(A)、敲除型病毒(B)和补回型病毒(C)转染Sf9细胞后的光镜观察

3 讨 论

传统的杆状病毒改造大多采用同源重组的方法进行，即将构建好的转移载体与病毒基因组DNA共转染宿主细胞，从而构建出发生了同源重组的病毒。然而这种方法有很大的局限性，因为当杆状病毒的必需基因被敲除后，病毒便无法进行复制产生子代病毒，从而无法得到重组病毒，也使得研究无法继续。随着科学的发展，Red/ET重组技术渐趋成熟，并成功运用于杆状病毒的基因敲除和基因补回，使得对杆状病毒的研究进入了一个前所未有的高度。目前，利用该项技术已经对许多基因进行了精确敲除，这对于研究杆状病毒的必需基因在病毒生命周期中的作用，以及在病毒复制中扮演的角色有着重要意义。

为了研究AcMNPVlef-10基因的功能区，首先要对该基因进行敲除。通过对AcMNPVlef-10基因的分析可知，lef-10基因的转录方向与上游基因ac53和下游基因vp1054、ac55的转录方向均一致，其中与上游基因ac53有3 bp的重叠区域，与下游基因vp1054有143 bp的重叠区域。如果对lef-10整个ORF进行敲除的话，可能会影响下游基因转录的起始。因此，本研究在敲除lef-10时考虑通过引进点突变使lef-10失活，以此确保对lef-10基因保守区域进行最小程度的破坏。引进点突变的方法是通过2次Red/ET重组：第1次重组引进rpsL-AMP抗性筛选标记，第2次重组通过链霉素反向筛选去除rpsL-AMP抗性筛选标记，同时引入相应的点突变。需要说明的是，虽然有商品化的rpsL-Kan筛选盒，但本试验却自行构建3rpsL-AMP筛选盒，主要原因是试验所用的AcMNPV Bacmid是由Zhao等[28]改造过的含有Kan抗性标记的筛选盒，所以无法使用商品化的筛选盒。本试验利用Red/ET重组技术成功构建了一次重组病毒，并利用链霉素反向筛选获得lef-10点突变的重组病毒。

本试验构建的载体可以与Bacmid发生重组，形成可以表达外源基因的重组病毒。为了研究AcMNPVlef-10缺失型重组病毒侵染细胞时是否会影响病毒的复制，构建了野生型、lef-10缺失型重组病毒以及lef-10补回型重组病毒，在普通光学显微镜下观察重组病毒在Sf9细胞内的复制情况，结果表明被lef-10缺失型重组病毒转染的细胞内部无法产生具有感染性的子代病毒粒子BV，从而无法造成细胞间的二次感染，也就是说lef-10基因是AcMNPV生活周期中的一个必需基因，其缺失会影响病毒DNA的复制，然而目前还不清楚lef-10基因如何精确调控病毒基因组的DNA复制。这些结果还说明，利用Red/ET系统的重组功能结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对靶基因进行点突变的方法是有效的。

本研究得到了AcMNPVlef-10基因点突变的重组病毒，后续将进一步通过构建含有截断lef-10基因的载体来研究AcMNPVlef-10的功能区。

4 结 论

本研究首次采用Red/ET系统结合rpsL反向筛选系统，构建了AcMNPVlef-10基因点突变的重组病毒，通过转染细胞试验证明AcMNPVlef-10基因是病毒增殖所必需的基因，该方法对以后进行杆状病毒基因改造具有一定的参考价值。

[1] Marc H V,Claude M.Virus taxonomy:Classification and nomenclature of viruses [R]//Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.San Diego: Academic Press,2000.

[2] Lu A,Miller L K.The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication [J].J Virol,1995,69:975-982.

[3] Rapp J C,Wilson J A,Miller L K.Nineteen baculovirus open reading frames,including LEF-12,support late gene expression [J].J Virol,1998,72:10197-10206.

[4] Mikhailov V S,Rohrmann G F.Baculovirus replication factor LEF-1 is a DNA primase [J].J Virol,2002,76:2287-2297.

[5] Wu C P,Huang Y J,Wang J Y,et al.Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus LEF-2 is a capsid protein required for amplification but not initiation of viral DNA replication [J].J Virol,2010,84:5015-5024.

[6] Ito E,Sahri D,Knippers R,et al.Baculovirus proteins IE-1,LEF-3,and P143 interact with DNAinvivo:A formal dehyde cross-linking study [J].Virol,2004,329:337-347.

[7] Yu M,Carstens E B.Identification of a domain of the baculovirusAutographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus single strand DNA-binding protein LEF-3 essential for viral DNA replication [J].J Virol,2010,84:6153-6162.

[8] Chen C J,Thiem S M.Differential infectivity of twoAutographacalifornicanucleopolyhedrovirus mutants on three permissive cell lines is the result of lef-7 deletion [J].Virol,1997,227:88-95.

[9] Lin G,Blissard G W.Analysis of anAutographacalifornicanucleopolyhedrovirus lef-11 knocKOut:LEF-11 is essential for viral DNA replication [J].J Virol,2002,76:2770-2779.

[10] McDougal V V,Guarino A.Autographacalifornicanuclear polyhedrosis virus DNA polymerase:Measurement of processing and strand displacement [J].J Virol,1999,73:4908-4918.

[11] Olson V A,Wetter J A,AFriesen P D.Oligomerization mediated by a helix-loop-helix-like domain of baculovirus IE1 is required for early promoter transactivation [J].J Virol,2001,75:6042-6051.

[12] Yoo S,Guarino L A.TheAurographacalifornicanuclear polyhedrosis virus ie2 gene encodes a transcriptional regulator [J].Virol,1994,202:746-753.

[13] KOol M,Ahrens C H,Goldbach R W,et al.Identification of genes in DNA replication of theAutographacalifornicabaculovirus [J].Proc NatI Acad Sci USA,1994,91:11212-11216.

[14] Yu W,Du Y,Quan Y P,et al.Characterization of late gene expression factor LEF-10 fromBombyxmorinucleopolyhedro virus [J].Virus Research,2013,175:45-51.

[15] Acharya A,Gopinathan K P.Characterization of late gene expression factors lef-9 and lef-8 fromBombyxmorinucleopolyhed rovirus [J].J Gen Virol,2002,83:2015-2023.

[16] Guarino L A,Dong W,Jin J.Invitroactivity of the baculovirus late expression factor LEF-5 [J].J Virol,2002,76:12663-12675.

[17] Lin G,Blissard G W.Analysis of anAutographacalifornicamulticapsid nucleopolyhedrovirus lef-6-null virus:LEF-6 is not essential for viral replication but appears to accelerate late gene transcription [J].J Virol,2002,76:5503-5514.

[18] Guarino L A,Mistretta T A,Dong W.Baculovirus lef-12 is not required for viral replication [J].J Virol,2002,76:12032-12043.

[19] Yamagishi J,Burnett E D,Harwood S H,et al.The AcMNPV pp31 gene is not essential for productive AcMNPV replication or late gene transcription but appears to increase levels of most viral transcripts [J].Virol,2007,365:34-47.

[20] Braunagel S C.Determination of the protein composition of the occlusion-derived virus ofAutographacalifornicanucleopolyhedro virus [J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(17):9797-9802.

[21] Imai N.Bombyx mori nucleopolyhedro virus orf8 encodes a nucleic acid binding protein that colocalizes with IE1 during infection [J].Arch Virol,2004,149:1581-1594.

[22] Tomalski M D,Eldridge R,Miller L K.A baculovirus homolog of a Cu/Zn superoxide dismutase gene [J].Virology,1991,184:149-161.

[23] Katsuma S.Genome-wide survey for baculoviral host homologs using the Bombyx genome sequence [J].Insect Biochem Mol Biol,2004,86:1123-1135.

[24] Li G.Characterization of AcMNPV with a deletion of ac68 gene [J].Virus Genes,2008,37(1):119-127.

[25] Xu H.Bombyxmorinucleopolyhedro virus ORF56 encodes an occlusion-derived virus protein and is not essential for budded virus production [J].J Gen Virol,2008,89:1212-1219.

[26] Deng F.Proteomics analysis ofHelicoverpaarmigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedro virus identified two new occlusion-derived virus-associated proteins,HA44 and HA100 [J].J Virol,2007,81:9377-9385.

[27] Ayres M D,Howard S C,Kuzio J,et al.The complete DNA sequence ofAutographacalifornicanuclear polyhedrosis virus [J]. Virol,1994,202:586-605.

[28] Zhao Y,Chapman D A,Jones I M.Improving baculovirus recombination [J].Nucleic Acides Res,2003,31:E6-6.

Disruption ofAcMNPVlef-10 by Red Recombination System in combination withrpsLcounter-selection

BAI Yu,XU Xiao-dong

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 To study the function of late expression factorlef-10 ofAutographacalifornicanucleopolyhedro virus (AcMNPV),the RedET Recombination System in combination withrpsLcounter-selection was used to introduce a single point mutation into theAcMNPVlef-10 gene.【Method】 Since the ORF box of thelef-10 gene partially overlaps the upstream geneorf53 and the downstream genevp1054,a single point mutation was introduced into theAcMNPVlef-10 gene to protect the complete gene sequence on both sides.First,we constructedrpsL-AMPscreening box.Then introduction of point mutation was done through two RedET Recombination steps:the first Recombination was introduction ofrpsL-AMPresistance selection marker into theAcMNPVlef-10 gene and the second Recombination was to introduce a single point mutation into theAcMNPVlef-10 gene throughrpsLcounter-selection,while removing therpsL-AMPresistance selection marker.Then,Sf9 cells were co-transfected with lef10-KO-Bacmid DNA and pTriEx1.1 as well as lef10-KO-Bacmid DNA and pTriEx-innateP-lef10.The co-transfection with wtBacmid DNA and pTriEx1.1 was sued as control.Then the infected cells were observed under the microscope.【Result】 Based on PCR identification of recombinant Bacmid and point mutations sequences,it was confirmedlef-10 gene had been disrupted.Co-transfection experiments showed that with the extension of the transfection time,vAclef-10KO-REPand vAcwtreplicated inSf9 cells to produce infectious virions BV.This resulted in secondary infection of neighboring cells and cell death.The production ability of infectious virions of vAclef-10KO-REPwas consistent with vAcwt.Because vAclef10-KOcan not produce infectious virions,the number of cells did not change significantly with the extension of the transfection time when using vAclef10-KOto transfectSf9 cells.【Conclusion】AcMNPVlef-10 gene has significant effects on replication of virus.

Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);lef-10;RedET recombination system;rpsLcounter-selection BAC modification system; gene disruption

时间:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.026

2014-04-24

陕西省自然科学基础研究计划项目(2011JM3002)

白 玉(1989-)，女，内蒙古包头人，在读硕士，主要从事杆状病毒lef-10基因功能的研究。 E-mail：807738718@qq.com

许晓东(1967-)，男，黑龙江甘南人，副教授，硕士生导师，主要从事分子病毒学研究。E-mail：xuxd@nwsuaf.edu.cn

Q786

A

1671-9387(2015)12-0181-10

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151111.1616.052.html