前列腺素E1减轻大鼠肺撞击伤后肺泡细胞凋亡

刘富春，黄 一，李学成，罗艳梅，高 军，张 浩

(中国人民解放军第三二四医院药剂科，重庆 404100)

前列腺素E1减轻大鼠肺撞击伤后肺泡细胞凋亡

刘富春，黄 一，李学成，罗艳梅，高 军，张 浩

(中国人民解放军第三二四医院药剂科，重庆 404100)

目的 探讨前列腺素E1(PGE1)对肺撞击伤后肺泡细胞凋亡的影响。方法雄性SD大鼠分为正常对照组、伤后对照组和伤后PGE1处理组。致伤后24 h检测动脉氧分压、肺系数，TUNEL染色检测肺泡细胞凋亡的整体情况。以蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测自噬相关蛋白及自噬调节蛋白NIX的表达情况。结果伤后24 h肺组织可见明显结构破坏及肺水肿。与正常对照组相比，伤后对照组动脉氧分压降低(P<0.05)，肺泡细胞凋亡指数增加(P<0.05)，同时肺组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及自噬调节蛋白NIX表达增加(P<0.05)。伤后 PGE1处理组动脉氧分压低于正常对照组(P<0.05)，但较伤后对照组显著改善(P<0.05)；肺泡细胞凋亡指数高于正常对照组，但显著低于伤后对照组(P<0.05)；肺组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及自噬调节蛋白NIX的表达虽然较正常对照组增加(P<0.05)，但显著低于伤后对照组(P<0.05)。结论PGE1减轻大鼠肺撞击伤后肺泡细胞凋亡，此作用可能是通过抑制NIX介导的细胞自噬，以及肺泡细胞自噬性凋亡实现。

前列腺素；细胞凋亡；自噬；肺泡细胞；NIX；

肺撞击伤主要是因为钝性暴力直接作用于胸部造成的闭合性损伤，常由于肺部和(或)其他脏器炎性反应严重失调而导致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞屏障损伤[1-2]。肺泡细胞特别是肺泡Ⅱ型上皮细胞被认为是修复肺泡细胞损伤的种子细胞[3]，但肺撞击伤时常伴随肺泡上皮细胞凋亡，因此有效抑制肺泡细胞凋亡有助于减轻肺撞击伤进展。另外，既往的研究证实，细胞自噬过度上调导致的自噬性凋亡增加是急性肺损伤引起的肺泡细胞凋亡的机制之一。既往研究证实前列腺素E1(prostaglandin E1,PGE1)能够减轻急性肺损伤的进展[4]，但具体作用机制仍未明晰。同时，鉴于前列腺素具有抑制细胞凋亡的作用[5-6]，本研究假设PGE1可能通过调节肺泡细胞自噬性凋亡而减轻肺撞击后肺泡细胞凋亡，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，体质量(245±10)g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。将实验动物分为正常对照组、伤后对照组和伤后PGE1处理组各20只。利用第三军医大学院野战外科研究所研制的BIM-Ⅲ水平式小型生物撞击机进行致伤。致伤前腹腔注射2%戊巴比妥(0.3 mL/100 g)麻醉，麻醉成功后将大鼠固定于特制动物夹板，前胸部正对撞击口，撞击用圆柱状金属弹头质量22 g，直径1.1 cm，距离鼠板水平距离18.0 cm，以220 kPa驱动压驱动弹头撞击致伤。正常对照组麻醉后不予以撞击，参考既往文献，伤后1 h内PGE1处理组由尾静脉注射Lipo-PGE1(10 μg/kg，北京泰德制药)，伤后对照组由尾静脉注射等量生理盐水。致伤后24 h将动物麻醉后断颈处死，取左下肺组织，部分肺组织冰冻切片后以4%多聚甲醛固定，其余组织-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 血气分析 各组大鼠(每组6只)处死前股动脉取血，肝素抗凝后以罗氏Compact 血气分析仪测定动脉血氧分压(PaO2)。

1.2.2 肺系数 各组大鼠处死后直接取全肺称质量，计算肺系数。计算公式：肺系数=全肺质量/体质量×100%。

1.2.3 TUNEL 检测细胞凋亡 采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，中国)检测肺组织细胞的凋亡。所有操作按说明书进行。每张切片在高倍视野下(×200)取5个视野，计数TUNEL阳性细胞及总细胞数。计算凋亡指数=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。每组切片分别来源于3只不同大鼠。

1.2.4 蛋白免疫印迹试验(Western blot)检测凋亡、自噬相关蛋白表达 取肺组织20 mg匀浆，RIPA裂解液[按1∶100添加苯甲基磺酰氟(PMSF)]裂解提取总蛋白，离心后取上清液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国)，按使用说明测定蛋白浓度。添加十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液后95 ℃变性5 min。每个样本取20 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛血清清蛋白(BSA)室温封闭1 h，孵育特异性抗体 Beclin-1(1∶200，Santa)、LC3Ⅱ(1∶200，Santa)、NIX(1∶500，Santa)、β-actin(1∶1 000，碧云天)于4 ℃过夜，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的免疫球蛋白G(IgG)抗体37 ℃孵育1 h，以ECL试剂盒行放射自显影，Quantity One软件分析条带吸光度值。

2 结 果

2.1 胸部撞击后肺组织损伤 在正常对照组，大鼠肺组织未见明显病变；伤后对照组和伤后PGE1处理组肺组织可见局限性血肿、肺挫裂伤、肺门血管破裂等。光镜下可见肺组织结构破坏，肺内广泛出血及水肿，肺泡内大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，细支气管内部分纤维蛋白渗出。伤后PGE1处理组其肺组织损伤程度光镜下与伤后对照组未见明显差别，见图1。

图1 肺组织HE染色(×400)

2.2 PGE1 处理改善PaO2，减轻肺水肿 与正常对照组相比，伤后对照组大鼠PaO2显著降低(P<0.05)。伤后PGE1处理组PaO2虽然低于正常对照组(P<0.05)，但较伤后对照组显著改善(P<0.05)。肺系数用于评价肺水肿程度，结果显示，与正常对照组比较，伤后对照组肺系数显著增加(P<0.05)，与PaO2变化趋势相似，伤后PGE1处理组的肺系数虽较正常对照组高(P<0.05)，但是显著低于伤后对照组(P<0.05)，见表1。

表1 不同组别大鼠PaO2和肺系数比较

a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.05，与伤后对照组比较。

2.3 PGE1减轻肺泡细胞凋亡 正常肺组织未见明显凋亡。致伤24 h后，与正常对照组相比，伤后对照组肺泡细胞凋亡指数较高[(0.90±0.14)%vs.(12.34±2.42)%,P<0.05]。伤后PGE1处理组肺组织凋亡虽然高于正常对照组[(0.90±0.14)%vs.(7.58±1.88)%,P<0.05]，但显著低于伤后对照组(P<0.05)。

A：Western blot检测不同组间肺组织内Beclin-1蛋白表达情况；B：Western blot检测不同组间肺组织内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。*：P<0.05，与正常对照组比较，#：P<0.05，与伤后对照组比较。

图2 PGE1抑制肺组织自噬水平

2.4 PGE1抑制肺组织自噬水平 以Western blot检测不同组之间肺组织自噬相关蛋白表达，结果显示，伤后对照组肺组织自噬相关蛋白Beclin-1的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值较正常对照组显著升高(分别增加93.1%、82.8%，P<0.05)，而伤后PGE1处理组肺组织Beclin-1的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值虽然较正常对照组增加(分别增加54.7%、51.5%，P<0.05)，但是显著低于伤后对照组(P<0.05)，见图2。

2.5 PGE1抑制肺组织NIX表达 与自噬变化相一致，伤后对照组肺组织NIX表达显著高于正常对照组(P<0.05)，而伤后PGE1处理组肺组织NIX蛋白表达水平虽然较正常对照组增加(P<0.05)，但是显著低于伤后对照组(P<0.05)，见图3。

*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与伤后对照组比较。

图3 PGE1抑制肺组织NIX表达。

3 讨 论

肺撞击伤属于急性肺损伤范畴，肺泡细胞细胞凋亡是导致其难治愈的机制之一。既往报道PGE1对缓解急性肺损伤有显著作用，但其内在机制仍不清楚。本研究观察PGE1在肺撞击伤后对肺泡细胞自噬性凋亡的影响。结果显示，PGE1处理能够减轻肺撞击伤后PaO2、减轻肺水肿，同时也能抑制肺泡细胞凋亡；PGE1可以抑制伤后肺组织自噬过度增加并抑制自噬调节蛋白NIX的表达。结果提示，PGE1对肺撞击伤具有一定的保护作用，此作用可能是通过下调NIX蛋白的表达及其介导的细胞自噬，从而减少肺泡细胞自噬性凋亡实现。

传统观念认为急性肺损伤是全身炎性反应综合征在肺部的表现，然而无论是传统的抗炎药物还是针对促炎因子的药物对急性肺损伤的抗炎治疗均未取得良好效果。随后众多学者把注意力转向细胞凋亡学说并证实肺泡上皮细胞凋亡是急性肺损伤的主要病理机制之一[7]。尽管已经认识到肺泡上皮细胞凋亡在急性肺损伤中的重要作用，但目前对如何改善或抑制凋亡仍无有效的治疗措施。

PGE1是目前临床上广泛使用的一种血管扩张剂，而既往研究发现PGE1静脉或者吸入给药能够改善脂多糖、油酸等引起的急性肺损伤[8-9]。本研究也发现，肺撞击伤后，静脉给予PGE1虽然未显著改善伤后肺组织病理改变特征，但是在肺功能方面能够改善PaO2、减轻肺水肿，说明PGE1在治疗肺撞击伤中具有一定的作用。既往关于PGE1改善急性肺损伤的机制研究发现PGE1除了能减轻肺血管阻力外，还可以抑制中性粒细胞聚焦及NF-κB介导的炎性反应等[10]。另外，近期研究发现，PGE1还具有抗细胞凋亡的作用[6]，因此，推测PGE1可能参与调节肺撞击伤后肺泡细胞凋亡。结果证实，经静脉给予PGE1后，肺泡组织的凋亡虽比正常对照组增加，但显著低于伤后对照组，说明PGE1具有拮抗肺损伤后肺泡细胞凋亡的作用。接下来本研究探讨了PGE1抑制肺泡上皮细胞凋亡的相关机制。既往有关急性肺损伤后肺泡上皮细胞凋亡的机制报道可分为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)介导凋亡，以及非Caspase介导的凋亡，而后者可能与NIX介导的细胞自噬性凋亡有关。NIX蛋白是一种线粒体外膜蛋白，也称BNIP3L(Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3-like)，是Bcl-2基因家族成员。它可以引起线粒膜通透性转换孔开放，膜电位降低，活性氧增加，诱发自噬过度增加从而促进细胞自噬性凋亡增加[11-13]。本研究发现，肺撞击伤后，肺泡细胞的凋亡增加，另外肺泡组织的自噬水平及NIX蛋白表达显著上调。结合既往研究结果，提示NIX蛋白介导的自噬性凋亡增加可能是肺撞击伤后肺泡组织凋亡的机制之一。而PGE1能够显著抑制肺泡细胞NIX蛋白表达及自噬水平，并降低肺泡细胞凋亡。这些结果提示PGE1可能是通过抑制NIX蛋白的表达从而抑制肺组织的自噬及自噬性凋亡。需要注意的是，PGE1对肺泡细胞的凋亡的影响还可能是通过影响Caspase介导的凋亡途径，这需要在以后的研究中进一步探讨。

综上所述，本研究观察到静脉给予PGE1能够改善肺撞击伤后PaO2、减轻肺水肿，其作用机制可能与PGE1拮抗肺泡细胞凋亡相关，而PGE1抑制肺泡细胞凋亡的机制可能是通过抑制NIX蛋白从而抑制过度的细胞自噬及自噬性凋亡相关。这些结果为临床应用PGE1治疗肺撞击伤提供了一定的理论基础。

[1]Tanaka S,Hayashi S,Fukushima S,et al.Investigation of a relationship between external force to shoulder and chest injury of WorldSID and THUMS in 32 km/h oblique pole side impact[J].Traffic Inj Prev,2013,14(Suppl):S64-76.

[2]Dannevig I,Solevåg AL,Saugstad OD,et al.Lung injury in asphyxiated newborn pigs resuscitated from cardiac arrest-the impact of supplementary Oxygen,longer ventilation intervals and chest compressions at different Compression-to-Ventilation ratios[J].Open Respir Med J,2012,6:89-96.

[3]Chen Y,Legan SK,Mahan A,et al.Endothelial-monocyte activating polypeptide Ⅱ disrupts alveolar epithelial type Ⅱ to type Ⅰ cell transdifferentiation[J].Respir Res,2012,13:1-4.

[4]Sio SW,Ang SF,Lu J,et al.Substance P upregulates cyclooxygenase-2 and prostaglandin E metabolite by activating ERK1/2 and NF-kappaB in a mouse model of burn-induced remote acute lung injury[J].J Immunol,2010,185(10):6265-6276.

[5]Horowitz JC,Peters-Golden M.Prostaglandin E2′s new trick:"decider" of differential alveolar cell Life and death[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,182(1):2-3.

[6]Muntane J,Montero JL,Lozano JM,et al.TNF-alpha but not IL-1alpha is correlated with PGE1-dependent protection against acute D-galactosamine-inducedliver injury[J].Can J Gastroenterol,2000,14(3):175-180.

[7]Sugahara K,Tokumine J,Teruya K,et al.Alveolar epithelial cells:differentiation and lung injury[J].Respirology,2006,11:S28-31.

[8]Xiao J,Zhong R,Shi SY,et al.An investigation of the protective effect of prostaglandin E1 liposome on acute lung injury in pig[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2008,20(6):345-348.

[9]王德明，龙宏杰，徐经大，等．前列腺素E1治疗犬油酸型急性肺损伤的实验观察[J]．南华大学学报:医学版，2003，31(3)：278-280,311．

[10]李湘灵，姜远旭．前列腺素E1脂微球制剂对大鼠急性肺损伤的影响[J]．数理医药学杂志，2009，22(1)：24-26．

[11]Dorn GW.Mitochondrial pruning by Nix and BNip3:an essential function for cardiac-expressed death factors[J].J Cardiovasc Transl Res,2010,3(4):374-383.

[12]Diwan A,Wansapura J,Syed FM,et al.Nix-mediated apoptosis links myocardial fibrosis,cardiac remodeling,and hypertrophy decompensation[J].Circulation,2008,117(3):396-404.

[13]Schwarten M,Mohrlüder J,Ma P,et al.Nix directly binds to GABARAP:a possible crosstalk between apoptosis and autophagy[J].Autophagy,2009,5(5):690-698.

《重庆医学》杂志对运用统计学方法的有关要求

1.统计学符号：按GB 3358-1982《统计学名词及符号》的有关规定，统计学符号一律采用斜体。

2.研究设计：应告知研究设计的名称和主要方法。如调查设计(分为前瞻性、回顾性或是横断面调查研究)，实验设计(应告知具体的设计类型，如自身配对设计、成组设计、交叉设计、析因设计、正交设计等)，临床试验设计(应告知属于第几期临床试验，采用了何种盲法措施等)；主要做法应围绕4个基本原则(重复、随机、对照、均衡)概要说明，尤其要告知如何控制重要非试验因素的干扰和影响。

4.统计学分析方法的选择：对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件及分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用χ2检验。对于回归分析，应结合专业知识和散点图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析；对于具有重复实验数据检验回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系做出全面、合理的解释和评价。

5.统计结果的解释和表达：应写明采用统计学方法的具体名称(如：成组设计资料的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等)，统计量的具体质(如：t=3.45，χ2=4.68，F=6.79等)；在用不等式表示P值的情况下，一般情况下选用P>0.05、P<0.05和P<0.01三种表达方式，无须再细分为P<0.001或P<0.000 1。当涉及总体参数(如总体均数、总体率)时，再给出显著性检验结果的同时，应再给出95%可信区间(CI)。

PGE1 alleviated alveolar cells apoptosis in rat lung impact injury model*

LiuFuchun,HuangYi,LiXuecheng,LuoYanmei,GaoJun,ZhangHao

(DepartmentofPharmacy,NO.324CentralHospitalofChinesePeople′sLiberationArmy，Chongqing404100,China)

Objective To investigate the effect of prostaglandin E1 (PGE1) on alveolar cells apoptosis in rat lung impact injury model.Methods SD rats were divided into 3 groups (normal control group,lung injury control group and PGE1 treated group).PaO2and pulmonary coefficient were detected after 24 h of impact.TUNEL labeling was used to evaluate apoptosis and Western blot was used to estimate protein expression levels of beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰand NIX.Results After 24 h of impacting,there were obvious structural damage and pneumonedema in rat lung.Compared to normal control group,the PaO2of lung injury control group decreased and the apoptosis of alveolar cells increased significantly(P<0.05).Furthermore,the expression levels of Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and NIX in the impacting control group were increased (P<0.05).In the PGE1 treated group,the PaO2were decreased compared to normal control group(P<0.05),but these expression levels were higher significantly than lung injury control group (P<0.05).The expression levels of apoptosis,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and NIX in the PGE1 treated group were increased compared to normal control group(P<0.05),but these expression levels were lower significantly than lung injury control group (P<0.05).Conclusion PGE1 could alleviate alveolar cells apoptosis after lung impacting injury,and which effect may ascribe to PGE1 inhibiting NIX-mediated autophagy and autophagic apoptosis of alveolar cells.

prostaglandins；apoptosis；autophagy；alveolar cells；NIX

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.23.006

重庆市卫生局医学科研项目(2013-2-302)。

刘富春(1976-)，主管药师，硕士，主要从事临床药学研究。

R642

A

1671-8348(2015)23-3187-03

2015-02-08

2015-07-15)