发酵法制备黄芪药渣饲料添加剂活性物质

竺利红，焦巧芳，尹小良，张 红，施跃峰*

（1.浙江省农业科学院a植物保护与微生物研究所，b浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，浙江杭州 310021；2.赵县农牧局，河北石家庄 051530；3.绍兴市越城区东湖镇农业综合服务中心，浙江绍兴 312001；4.浙江省医学科学院，浙江杭州 310013）

发酵法制备黄芪药渣饲料添加剂活性物质

竺利红1ab，焦巧芳2，尹小良3，张 红4，施跃峰1ab*

（1.浙江省农业科学院a植物保护与微生物研究所，b浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，浙江杭州 310021；2.赵县农牧局，河北石家庄 051530；3.绍兴市越城区东湖镇农业综合服务中心，浙江绍兴 312001；4.浙江省医学科学院，浙江杭州 310013）

以黄芪药渣为发酵底物，以棘孢木霉为发酵菌种，制备中药渣饲料添加剂，检测产物中各类活性物质。结果表明，黄芪药渣经棘孢木霉发酵后，能产生以β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶为主的丰富酶系；与发酵前相比，黄芪甲苷在发酵液中的释放量增加了4倍；发酵产物对变形杆菌、沙门氏杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌有较强的抑制作用。表明利用棘孢木霉发酵黄芪药渣制备饲料添加剂具有较好的开发潜力。

黄芪；棘孢木霉；发酵；黄芪甲苷

黄芪为豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的根，是中医临床最常用的大宗药材之一。黄芪的主要活性物质为黄芪皂苷、黄酮、多糖、单糖等，具有补气升阳、益气固表、托毒生津和利水消肿功效，在兽医临床上可用于防治鸡传染性法氏囊病，提高蛋鸡产蛋率和饲料报酬、降低淘汰死亡率，提高肥育猪的生长和屠宰性能，改善肉的品质［1-2］。

目前黄芪及复方制剂的提取方法主要是醇提法和水提法，产生的黄芪药渣仍含有丰富的活性物质，可作为饲料添加剂被再次利用［3］。目前中草药渣在饲料添加剂中的运用大多采用干燥粉碎后按一定比例直接添加到饲料中的方法。药渣中活性成分、蛋白质等营养元素往往包裹在细胞壁内，植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构，除草食动物外，其他动物不能消化吸收纤维素、半纤维素等物质。因此，药渣作为饲料添加剂直接添加，对非草食动物而言，活性成分和营养元素并不能被很好地吸收，导致其在饲料中添加量大增，在浪费资源的同时也破坏了饲料的营养配比，甚至大多数情况下因添加量太大而无法配制；同时，药渣中主要组成部分纤维素和半纤维素等也因为无法被非草食动物吸收而造成浪费。

微生物在代谢过程中可分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，不仅可以水解植物细胞壁的纤维素、半纤维素、果胶质等，将它们转化成动物和人体可直接利用的小分子糖、单糖、多肽和氨基酸等，提高营养成分，还可以使植物细胞破裂，有利于有效成分和营养物质溶出；同时微生物自身还能产生丰富的次生代谢产物，它们中的一些活性物质可与中药有效成分发生协同作用扩大药效。本试验利用棘孢木霉（Trichoderma asperellum）发酵黄芪药渣制备饲料添加剂，并对其活性物质展开了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

1.1.2 培养基

肉汤培养基。蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 2.5 g，K2HPO42.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，调pH值7.0。

PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂18 g，水1 L，pH值自然。

药渣培养基。黄芪药渣1 g，麸皮1.4 g，淀粉1.4 g，水35 m L，pH值5.5。

对照培养基。麸皮1.4 g，淀粉1.4 g，水35 mL，pH值5.5。

1.2 方法

1.2.1 黄芪药渣的制备

取黄芪150 g，加600 mL蒸馏水浸泡30 min，煮沸20 m in，倒掉浸煮液；再加600 m L蒸馏水继续煮沸20 m in，倒掉浸煮液；105℃烘干2 h至恒重，粉碎，过60目筛。

普陀区桃浦镇北环水系长度约为3500m，宽度为8～18m，水域面积为 4.1×104m2，水域深度为 0.7～2.5m。在对水质特点进行分析时，发现由于受到多年工业废水、生活污水以及雨污混流等因素的影响，导致水域内的污染物严重积累，河水的流动性相对较差，甚至出现季节性“黑臭”的问题，严重影响了城市美观。雨季时，会有大量的雨水和污水流入，经过2015年清淤处理后，虽然可以接纳一定点源以及面源污染物，但仍有大量的污染物进入河道内，影响了河道排污口的排污效果。实地考察结果显示，河道内依然有少量鱼群存活，河道两侧有少量挺水植物生长，整个河道内并无任何沉水植物生长。

1.2.2 黄芪药渣发酵液的制备

取新鲜培养的棘孢木霉PDA斜面，刮下孢子，用无菌生理盐水制成浓度为1×108mL-1的孢子悬浮液。按3%的接种量接入药渣培养基中，28℃，200 r·min-1，振荡培养120 h。然后9 000 r·min-1离心10 m in，取上清液，备用。

1.2.3 酶活性测定

取上述上清液，检测羧甲基纤维素钠酶（CMC酶）、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果胶酶的活性，具体测定方法参照文献［4-8］。

1.2.4 黄芪甲苷含量测定

取上清液15 m L，用10 m L水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层。用15 m L 1%NaOH溶液洗涤2次，15 m L水饱和正丁醇洗涤2次至中性。80℃水浴蒸干正丁醇层，用3 m L甲醇溶解，0.45μm滤膜注射过滤后用于HPLC测定。色谱柱采用Sunfire柱，流动相为乙腈∶水43∶57，流速为1 mL·min-1，检测波长203 nm，进样量为10μL。配制黄芪甲苷标准品浓度为0.5 mg·mL-1。测定样品及标准品的峰面积，药渣发酵液中黄芪甲苷的含量计算公式：

式中C为样品中黄芪甲苷含量，A为样品HPLC图谱的峰面积；B为标准品HPLC图谱的峰面积。

1.2.5 抑菌活性测定

采用杯碟法。将0.1 m L检测菌液（菌数约为107m L-1）均匀涂在肉汤固体平板上，室温干燥30 m in后，将牛津杯（内径为6 mm）均匀放置在平板上，吸取0.1 m L药渣发酵上清液于杯中，37℃培养24 h，测量抑菌圈直径。各重复3次，取平均值。设置2个对照，CK1为牛津杯中添加没有接菌的空白药渣培养基上清液，CK2为棘孢木霉在对照培养基上的发酵上清液。

2 结果与分析

2.1 酶活性

棘孢木霉在黄芪药渣培养基上培养48，60，72，84和96 h时，分别测定CMC酶、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和果胶酶的活性，测定结果见表1。结果表明，棘孢木霉能在含有黄芪药渣的培养基上较好地生长并产生丰富的酶系，培养60 h时，CMC酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶的最大酶活性均超过1 000 U·m L-1。

表1 不同培养时间的酶活测定结果U·m L-1

2.2 黄芪甲苷

黄芪甲苷标准品的HPLC图谱显示，本研究中HPLC系统的黄芪甲苷吸收峰出现在第4 min（图1）。因此，通过计算试验样品HPLC图谱在第4 min的吸收峰面积，可以得出黄芪药渣发酵液中黄芪甲苷的含量。结果表明，黄芪药渣发酵0，60，72，84，96和120 h后，其上清液中黄芪甲苷的含量分别为（0.11±0.027）%，（0.22±0.003）%，（0.28±0.014）%，（0.41±0.036）%，（0.57± 0.027）%和（0.53±0.041）%，表明黄芪药渣经棘孢木霉发酵后，细胞壁被降解和破坏，胞内的黄芪甲苷被逐步释放出来，发酵96 h时黄芪甲苷含量达到最高。

2.3 抑菌活性

取发酵96 h的药渣发酵液，检测其对变形杆菌、沙门氏杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌5种常见细菌的抑菌活性，结果如表2所示。棘孢木霉和黄芪药渣对5种细菌的抑菌圈直径均为0 mm，表明棘孢木霉和黄芪药渣本身没有抑菌活性；而黄芪药渣发酵液对5种细菌的抑菌圈直径为19.1～29.9 mm，表明黄芪药渣经过棘孢木霉发酵后发酵液中产生了具有抑菌作用的活性物质。

图1 黄芪甲苷标准品HPLC图谱

表2 药渣发酵液的抑菌活性

3 小结与讨论

棘孢木霉能在含有黄芪药渣的培养基中较好地生长，而且能产生β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、滤纸酶和CMC酶等，这些酶不仅可以降解黄芪药渣的细胞壁，释放出胞内残留的黄芪甲苷，还能将细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶质等转化为动物可直接利用的小分子糖、单糖、多肽和氨基酸等，提高营养成分，促进动物对饲料中营养物质的吸收。同时棘孢木霉自身还能产生丰富的次生代谢产物，其中的一些活性物质可以与黄芪的有效成分发生协同作用扩大药效，产生较好的抑菌活性。本文仅对添加棘孢木霉的黄芪药渣发酵液的活性物质作了初步的研究，接下来将进一步改良菌种，改进发酵工艺，提高各类活性物质在发酵产品中的产量，并扩大中药渣的种类，研制出新型饲料添加剂，以满足市场的需求。

［1］ 梅洪睿，云霞，杨红，等.黄芪中主要活性成分的分离提取研究进展［J］.分析试验室，2008，27（z2）：242-243.

［2］ 朱志刚，胡建刚，章华其，等.中草药饲料添加剂对肥育猪生长和肉质的影响［J］.浙江农业科学，2011（2）：423-425.

［3］ 黄小光，邝哲师.中药渣作为饲料添加剂的应用［J］.广东饲料，2007，16（6）：32-33.

［4］ Horikoshi K，Nakao M，Kurono Y，et al.Cellulases of an alkalophilic Bacillus strain isolated from soil［J］.Canadian Journal of Microbiology，1984，30（6）：774-779.

［5］ Ghose T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and Applied Chem istry，1987，59（2）：257-268.

［6］ Goodenough P W，Kekos D，Macris B J.Purification and characterization of an extracellularβ-glucosidase with transglycosylation and exo-glucosidase activities from Fusarium oxysporum［J］.European Journal of Biochem istry，1994，224（2）：379-385.

［7］ 张洁，蔡敬民，潘仁瑞.芽孢杆菌木聚糖酶测定条件研究［J］.微生物学杂志，1997（2）：33-34.

［8］ 童娟.果胶酶高产菌株AspT7的分离及筛选鉴定［J］.西华大学学报：自然科学版，2012，31（6）：102-105.

（责任编辑：侯春晓）

S 816.7

：A

：0528-9017（2015）10-1651-03

文献著录格式：竺利红，焦巧芳，尹小良，等.发酵法制备黄芪药渣饲料添加剂活性物质［J］.浙江农业科学，2015，56（10）：1651-1653.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151043

2015-05-14

竺利红（1973-），女，浙江嵊州人，副研究员，硕士，主要从事微生物农药研究工作。E-mail：zhulh@mail.zaas.ac.cn。

施跃峰。E-mail：shiyf2003@sina.com。