脓毒症患者血中CD4+CD25+调节性T细胞水平与机体细胞免疫状态的相关性研究

耿延青

浙江省温岭市第一人民医院ICU，浙江温岭317500

脓毒症患者血中CD4+CD25+调节性T细胞水平与机体细胞免疫状态的相关性研究

耿延青

浙江省温岭市第一人民医院ICU，浙江温岭317500

目的探讨脓毒症患者CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的水平与细胞免疫的关系。方法以2013年7月～2014年6月浙江省温岭市第一人民医院收治的脓毒症患者53例为观察组。将观察组患者按病情分为脓毒症组（18例）、严重脓毒症组（21例）、脓毒症休克组（14例）；按28 d预后情况分为死亡组（16例）和存活组（37例）。另选取25名健康者为对照组。用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg及T细胞亚群水平并进行组间比较。结果CD4+CD25+Treg表达率：脓毒症休克组＞严重脓毒症组＞脓毒症组＞对照组，各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平：脓毒症组＞对照组＞严重脓毒症组＞脓毒症休克组，各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。CD8+水平各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。死亡组CD4+CD25+Treg表达率明显高于存活组（P＜0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明显低于存活组（P＜0.05）；CD8+水平两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论脓毒症患者Treg细胞水平增高，可能导致T淋巴细胞亚群水平降低，在预测患者预后方面有一定作用。

脓毒症；细胞免疫；CD4+CD25+调节性T细胞

脓毒症（sepsis）是感染导致的炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。脓毒症造成多器官功能衰竭是严重创伤患者死亡的主因之一。已往研究认为，脓毒症是过度炎性反应的一系列综合征，也就是机体自身灭活病原体的免疫机制被过度激活，导致炎性反应失控，从而引起机体自身损伤，导致多器官功能衰竭甚至死亡。对脓毒症发病机制的深入探索揭示，除了病原菌及其毒素对正常组织的侵害之外，机体自身免疫功能失衡也在脓毒症的发病及进展中也起着重要作用［1］。免疫亢进与免疫抑制两种病理状态同时存在，加剧了脓毒症的进展。近年研究发现，机体中存在着CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）。脓毒症患者Treg水平升高，从而启动免疫抑制效应，诱发T淋巴细胞过度凋亡，这正是脓毒症患者免疫功能紊乱的发生机制［2］。本研究检测了脓毒症患者Treg细胞与T细胞亚群水平，分析两者的相关性及与脓毒症患者病情与预后的关系，现总结报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年7月～2014年6月在浙江省温岭市第一人民医院（以下简称“我院”）治疗的脓毒症患者53例为观察组。纳入标准：符合国际脓毒症定义会议制订的诊断标准。排除标准：①患有自身免疫系统疾病；②急性脑卒中；③心肌梗死；④病毒性肝炎；⑤HIV感染；⑥入院前3个月内使用过激素或免疫抑制剂者。入选患者男31例，女22例；年龄31～69岁，平均（58.52± 13.46）岁。疾病构成：消化道穿孔破裂术后21例；胆囊坏死及重症胆管炎12例；肠梗阻术后9例；肺部感染11例。选取25名健康者为对照组，男15例，女10例；年龄32～65岁，平均（56.25±14.62）岁。将观察组患者按疾病严重程度分为脓毒症组（18例）、严重脓毒症组（21例）、脓毒症休克组（14例）；按28 d预后情况分为死亡组（16例）和存活组（37例）。

1.2 方法

1.2.1 一般监测指标监测记录血乳酸水平、氧合指数；评估急性生理和慢性健康评分（APACHEⅡ评分）。血乳酸水平检测仪器为美国雅培I-Stat血液分析仪。抽取动脉血1 mL，应用电极法测定血乳酸值。氧合指数通过测定动脉氧分压后计算得出（氧合指数=动脉氧分压/吸入氧浓度）。APACHEⅡ评分包括急性生理评分、年龄评分、慢性健康评分三部分，总分0～71分。

1.2.2 试验指标符合脓毒症诊断标准的患者于入选当天采肘静脉血10 mL，4 h内应用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg及T细胞亚群水平。另25名例健康者作为对照组同期进行试验。

试剂与仪器：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD25单抗，藻红蛋白（PE）标记的CD4单抗，CD25同型阴性对照试剂，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS试剂（美国Beckman-Coulter公司），细胞膜渗透性试剂盒（美国eBioscience公司）。流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司）。

CD4+CD25+Treg检测：将25μL抗凝全血加入试管中，再添加5μL CD25-FITC与5μL CD4-PE，混匀并在室温环境下避光反应15 min，添加500μL溶血剂，放置于37℃水浴箱中保存10 min，然后上流式细胞仪检测。T细胞亚群检测：取100μL全血，采用全血流式细胞仪三色标记法（直接免疫荧光标记法），确定CD3+、CD4+、CD8+并计算CD4+/CD8+。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般临床资料比较

不同病情患者各指标比较：血乳酸水平、APACHEⅡ评分，脓毒症休克组＞严重脓毒症组＞脓毒症组（P＜0.05）；氧合指数，脓毒症组＞严重脓毒症组＞脓毒症休克组（P＜0.05）。见表1。

不同预后患者各指标比较：存活组血乳酸水平、APACHEⅡ评分低于死亡组（P＜0.05）；存活组氧合指数高于死亡组（P＜0.05）。见表2。

2.2 各组CD4+CD25+Treg表达率与T细胞亚群水平比较

不同病情患者各指标比较：CD4+CD25+Treg表达率，脓毒症休克组＞严重脓毒症组＞脓毒症组＞对照组（P＜0.05）；CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平，脓毒症组＞对照组＞严重脓毒症组＞脓毒症休克组（P＜0.05）；CD8+各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

不同预后患者各指标比较：死亡组CD4+CD25+Treg表达率明显高于存活组（P＜0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+明显低于存活组（P＜0.05）；CD8+两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表1 不同病情患者临床资料比较（x±s）

2.3 各指标相关性分析

脓毒症患者CD4+CD25+Treg表达率与APACHEⅡ评分呈正相关（r=0.793，P＜0.05）；与血乳酸水平呈正相关（r=0.627，P=0.01）；与CD4+/CD8+呈负相关（r=-0.623，P＜0.05）。

表2 不同预后患者临床资料比较（x±s）

表3 各组CD4+CD25+Treg表达率与T细胞亚群水平比较（x±s）

3 讨论

3.1 促炎/抗炎反应失衡促进脓毒症发病的机制

脓毒症的本质是机体对感染的过度免疫反应。目前认为促炎反应/抗炎反应动态失衡在脓毒症的发生发展中起重要作用。促炎/抗炎反应过程可分为两个阶段：

第一个阶段是炎症反应综合征期。此时期的显著特征是细胞免疫状态呈增高趋势，主要为大量产生TNF-α、IL-1β等前炎症细胞因子，使机体的炎性反应被充分激活，导致单核细胞急剧增殖，同时活性水平增高，分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等细胞因子，诱导抗原性T淋巴细胞活化。TNF-α、IL-1和IL-6也是脓毒症早期的促炎因子，可以通过促进自由基、缓激肽、组胺等产生，激活补体等，加重脓毒症患者的组织损伤［3］。另外，在脓毒症患者的促炎反应还表现为前列腺素E2（PGE2）和转化生长因子-β（TGF-β）合成增多，对机体的免疫功能产生了很大的影响［4］。

第二个阶段是代偿性抗炎反应期。激发炎症反应综合征之后，随着脓毒症促炎反应发展，在脓毒症的后期，机体启动代偿性抗炎反应，进入免疫抑制状态，严重者甚至出现免疫麻痹，其典型表现是CD4+T淋巴细胞以及B淋巴细胞不断出现凋亡，而且增殖能力明显降低，其造成的免疫抑制是脓毒症病理生理机制的关键环节，使机体对病原体的易感性明显增加。同时，在机体的负向调控机制中，细胞因子也发挥了重要的作用。IL-10是由多种细胞（如单核细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞等）分泌的抗炎细胞因子，是机体重要的免疫调节因子，作为抗炎因子主要对单核/巨噬细胞发挥影响，抑制巨噬细胞的黏附、激活。随着IL-10等抗炎细胞因子水平升高以拮抗过度产生的前炎症细胞因子，而前炎症细胞因子水平明显降低，导致机体免疫功能低下，尤其是抗感染的功能严重受损，成为病情进一步恶化的主要原因。研究证实，IL-10水平升高被认为与脓毒症时免疫功能紊乱相关［5］。有报道显示，应用相应的抗原和IL-10反复刺激可以抑制细胞因子，诱导特异性调节性T淋巴细胞增殖、克隆，从而发挥免疫抑制作用。

3.2 Treg细胞对脓毒症免疫功能的影响

在动物和人类脓毒症患者中，均被证实发生了大量CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞凋亡。秦庆华［6］指出，大约1/2由于脓毒症致死的患者表现为淋巴细胞的凋亡增加，虽然未发现CD8+T淋巴细胞等的数量出现明显减少，但CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞浓度均显著降低。由于淋巴细胞的大量凋亡，使活化的T淋巴细胞不断被清除，这诱导了T淋巴细胞的克隆无反应性，导致其对抗原刺激失去反应，无法对抗病原体的侵袭，并且分泌细胞因子的能力也明显受到抑制。伴随着淋巴细胞大量凋亡的还有树突状细胞，后者是功能最强的抗原递呈细胞，其凋亡使细胞的抗原递呈能力明显受损，进而引起CD4+T淋巴激活功能障碍，进一步加剧了机体的免疫功能异常反应。

表4 不同预后患者CD4+CD25+Treg表达率与T细胞亚群水平比较（x±s）

CD4+CD25+Treg是1995年Sakaguchi等在小鼠体内发现的，其在正常人和小鼠外周血CD4+T细胞中的含量占1%～2%，主要特征性表达CD25（IL-2受体的A链），具有分泌IL-10与PGE2的功能，是一类重要的免疫抑制细胞，广泛参与多种免疫调节机制。近年来较多研究表明，CD4+CD25+Treg在脓毒症复杂的免疫调节中发挥着对细胞免疫的抑制作用，可影响机体的天然免疫和获得性免疫。盛志勇等［7］认为，脓毒症患者机体的免疫反应倾向于Th2型，Th2型细胞因子生成增多而Th1型细胞因子产生减少，明显损害了机体的细胞免疫功能。Treg可以抑制CD4+/CD8+T淋巴细胞功能，介导Th1向Th2反应漂移，调节促炎、抗炎介质水平，下调树突状细胞表面共刺激分子的表达，影响免疫细胞如单核巨噬细胞、中性粒细胞的凋亡和增殖，特别是诱导T淋巴细胞的凋亡［8］。研究表明，Treg细胞水平与脓毒症的发病存在密切关系，脓毒症发病时Treg水平明显升高。在脓毒症患者中，CD4+CD25+Treg升高在死亡者中多见，提示CD4+CD25+Treg在某种程度上能够表现脓毒症患者病情的严重程度，能够为预测患者的预后提供依据［9］。Zhang等［10］从基因水平证实上述结论，其研究发现，脓毒症患者Treg细胞的特异性标志Foxp3 mRNA明显增多。Hein等［11］研究报道脓毒症患者Treg水平与ASPsⅡ及乳酸水平存在负相关。

本研究结果显示，CD4+CD25+Treg表达率：脓毒症休克组＞严重脓毒症组＞脓毒症组＞对照组；脓毒症组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+明显高于对照组，严重脓毒症组和脓毒症休克组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+则显著下降。相关性分析表明：脓毒症患者CD4+CD25+Treg表达率与APACHEⅡ呈正相关，与乳酸水平呈正相关，与CD4+/CD8+呈负相关。T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+是机体的免疫功能状态的重要指标。Inoue等［12］研究发现，采用干预措施减少CD4+和CD8+的凋亡，能够改善脓毒症的生存率。这说明随病情加重，脓毒症患者Treg水平呈上升趋势，从而加剧免疫无反应状态。有关Treg诱导淋巴细胞凋亡的机制，可能有以下多种不同的途径：①IL-2是细胞增殖信号，在T淋巴细胞增殖过程中起着重要的激活作用。Treg细胞上的CD25能够与效应细胞竞争结合IL-2，使IL-2无法正常发挥增殖信号功能［13］。②Treg细胞能够诱导IL-10水平的升高，从而发挥免疫抑制效应。③Treg细胞能够激活FAS和FASL，通过Caspase级联反应，诱发T细胞彼此杀伤或直接凋亡。④Treg细胞经TCR介导的信号刺激活化后，能导致免疫亢进转向免疫抑制。随着脓毒症病情的加重，Treg数量增加，免疫抑制加剧，最终导致患者免疫麻痹，甚至死亡。已有研究表明，通过使用胸腺肽，诱导和促进T淋巴细胞的分泌与成熟，能够有效提高IL-2的活性及受体表达水平，从而对脓毒症的免疫抑制产生刺激作用，逆转其免疫抑制状态，尤其是对于轻中度的免疫抑制状态能够通过上述治疗取得良好效果，而重度免疫抑制者经过较长时间持续治疗也能够获益［14］。进一步证明免疫抑制的形成与改善是影响患者预后的重要因素。

综上所述，临床上对脓毒症患者检测Treg水平能够反映患者的细胞免疫状态，对患者的预后有一定预测作用。但由于目前相关的临床研究还较少，其确切的调控机制还有待进一步深入探讨。由于脓毒症患者的免疫失衡涉及各种细胞因子及炎症介质，而且与神经、内分泌因素的调节作用存在密切关系，因此，仅分析某几种细胞或细胞因子的相关性，不可能全面了解其根本的发病机制。随着对Treg细胞的免疫调节功能认识的日益深化，对脓毒症的临床干预的切入点将会越来越多，从而为防治脓毒症及其他感染性疾病提供可靠的新手段。

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The relationship between CD4+CD25+Treg cells and cell immune state in patients with sepsis

GENG Yanqing
Department of ICU,The First People's Hospital of Wenling City,Zhejiang Province,Wenling 317500,China

ObjectiveTo investigate the relationship between level of CD4+CD25+Treg cells and cell immune state in patients with sepsis.Methods53 patients with sepsis treated in the First People's Hospital of Wenling City from July 2013 to June 2014 were selected as observation group.The observation group was divided into sepsis group(18 cases), severe sepsis group(21 cases),and septic shock group(14 cases)according to the disease severity;and divided into death group(16 cases)and survival group(37 cases)according to the treatment result.25 healthy individuals served as controls.The expression of CD4+CD25+Treg cells and T-lymphocyte subsets was detected by flow cytometry.The expression of CD4+CD25+Treg cells and T-lymphocyte subsets within groups was compared.ResultsThe expression rate of CD4+CD25+Treg cells:septic shock group＞severe sepsis group＞sepsis group＞control group,with significant difference of those groups(P＜0.05).The level of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+:sepsis group＞control group＞severe sepsis group＞septic shock group,with significant difference of those groups(P＜0.05).There was no significant difference in CD8+of these groups(P＞0.05).The expression of CD4+CD25+Treg cells in death group was higher than that in survival group(P＜0.05),the levels of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+in death group was lower than those in survival group (P＜0.05).There was no significant difference in CD8+between death group and survival group(P＞0.05).ConclusionThe expression of CD4+CD25+Treg cells increased in patients with sepsis,which maybe reduce the levels of T lymphocyte subsets and has clinical value to assess the prognosis.

Sepsis;Cell immunity;CD4+CD25+Treg cells

R392

A

1673-7210(2015）01(c）-0007-05

2014-09-30本文编辑：程铭）

浙江省温岭市科研计划项目（编号2011WLCB0104）。