高效液相色谱法测定霉茶成分及其对血管紧张肽转化酶的抑制作用*

吴勇，罗弘，王瑞，谭永霞，胡俊杰，张宝徽，田先翔，郑国华，张筱祎

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，武汉 430065)

高效液相色谱法测定霉茶成分及其对血管紧张肽转化酶的抑制作用*

吴勇1，2，罗弘1，王瑞1，2，谭永霞1，2，胡俊杰1，2，张宝徽1，2，田先翔1，2，郑国华1，2，张筱祎1

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，武汉 430065)

目的利用高效液相色谱法测定霉茶成分对血管紧张肽转化酶(ACE)的抑制作用。方法以马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)为反应底物，经ACE催化生成的马尿酸为测定指标，分别考察霉茶总黄酮、二氢杨梅素、杨梅素对ACE的抑制作用。采用Welchrom C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为水(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)：乙腈(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)=78：22，柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长228 nm，进样量10 μL。结果马尿酸在0.05～5.00 μg范围内其进样量与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)，霉茶总黄酮、二氢杨梅素对ACE抑制率>75%。结论经该法检测，霉茶总黄酮、二氢杨梅素对ACE均有较强抑制作用。该方法简单、灵敏、重复性好，可用于ACE抑制药的体外活性筛选。

霉茶成分；血管紧张肽转化酶；抑制作用；含量测定；色谱法，高效液相

血管紧张肽转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)主要参与调节肾素-血管紧张肽-醛甾酮系统。其作用主要使血管紧张肽Ⅰ(angiotensinⅠ)转化成血管紧张肽Ⅱ(angiotensinⅡ)，而后者具有明显的收缩血管作用，可使血压升高。血管紧张肽转化酶活性提高，将导致血管紧张肽Ⅱ生成量增加，并使缓激肽钝化，从而导致高血压[1-2]。ACE的抑制药已开发成为临床用于治疗高血压的一线药物，如卡托普利、依那普利等。霉茶来源于葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄(AmpelopsisgrossedentataDiels et.Gilg)，具有清热凉血的功效，对原发性高血压、头昏目胀等病症具有较好的疗效[3]。霉茶中含有丰富的黄酮类化合物，其中二氢杨梅素和杨梅素为其主要的黄酮类成分[4]。笔者采用高效液相色谱法测定霉茶总黄酮、二氢杨梅素、杨梅素对ACE的抑制作用，以对霉茶降血压的有效成分进行初步筛选。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Ultimate3000型，美国戴安公司)、UWD-3x00紫外检测器、低温高速离心机(CR21GⅡ型，HITACHI CENTRIFUGE日本Hitachi Koki Co.Ltd)、超级数显恒温水浴(501A型，上海苏进仪器设备厂)、调速多用振荡器(HY-4型，常州国华电器有限公司)、Eppendorf移液器(德国艾本德股份公司)。

1.2 试药 卡托普利对照品和马尿酸对照品均购于中国食品药品检定研究院，批号分别为：100318-201103、140738-200501，含量>98%；ACE和马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)(均购于美国Sigma公司，批号分别为：SLBD2091V，SLBC8836V)；二氢杨梅素对照品和杨梅素对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，批号分别为：091216，090531，含量>98%)；霉茶总黄酮由湖北中医药大学中药药剂研究室提供，从显齿蛇葡萄的干燥茎叶提取制备，其采于湖北恩施自治州来凤县，经湖北中医药大学生药学教研室陈科力教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄(AmpelopsisgrossedentataDiels et.Gilg)；经紫外分光光度法测定总黄酮纯度为71.45%，其中二氢杨梅素和杨梅素经高效液相色谱法测定纯度分别为61.82%，5.29%；色谱乙腈(天津博迪化工股份有限公司)；三乙胺、甲醇、甲酸、硼酸等均为国产分析纯试剂，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Welchrom C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为水(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)：乙腈(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)= 78：22，柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长228 nm，进样量10 μL。

2.2 测定原理 恒温水浴时，HHL在ACE的催化下水解生成马尿酸。实验组中ACE的活性受到血管紧张肽转化酶抑制药(angiotensin converting enzyme inhibition，ACEI)的抑制作用，生成的马尿酸的量比对照组少。因此，可以通过测定马尿酸的生成含量来评价ACEI对ACE活性的抑制率，计算公式为：R=(1-B/A)×100%，式中，R为ACEI样品对ACE活性的抑制率，A为对照组生成马尿酸的峰面积，B为实验组生成马尿酸的峰面积。

2.3 溶液的配制 马尿酸对照品溶液的制备：按所需浓度精密称取马尿酸对照品适量，用双蒸水稀释制得马尿酸对照品溶液。HHL溶液的配制：精密称取HHL粉末17.25 mg置5 mL量瓶中，以0.1 mol·L-1硼酸缓冲液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化钠) 溶解、稀释至刻度线，得3.45 mg·mL-1HHL溶液。卡托普利溶液的配制：按所需浓度精密称取适量卡托普利对照品，用0.1 mol·L-1硼酸缓冲液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化钠)溶解、稀释，即得。ACE溶液的配制：将ACE 1 U置10 mL量瓶中，0.1 mol·L-1硼酸缓冲液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化钠)稀释至刻度线，即得0.1 U·mL-1ACE溶液。样品溶液的配制：精密称取霉茶总黄酮粉末适量，用0.1 mol·L-1硼酸缓冲液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化钠)溶解，再用相同缓冲溶液稀释到所需浓度，制成样品溶液；同法将二氢杨梅素和杨梅素加缓冲液制成相应样品溶液。

2.4 供试品的配制 空白对照组：用移液器分别吸取HHL溶液50 μL、缓冲溶液20 μL和ACE溶液10 μL置于0.5 mL离心管内混匀。实验组：用移液器分别吸取HHL溶液50 μL、抑制药溶液(卡托普利或霉茶成分) 20 μL、ACE溶液10 μL置0.5 mL离心管内混匀。空白对照组与实验组溶液在37 ℃恒温水浴中反应 40 min后，加入乙腈120 μL终止反应，震荡10 s后，10 000 r·min-1(r=250 mm)离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。

2.5 高效液相色谱法分析 在“2.1”项条件下，ACE活性抑制反应体系的高效液相色谱如图1所示，马尿酸保留时间约在5.4 min，保留时间较短，对筛选ACEI有利。马尿酸的峰与相邻峰之间分离度达到2.0以上，分离效果较好。空白对照组(图1B)与实验组(图1C)相比峰面积明显增大，实验组几乎检测不到马尿酸的峰，说明实验组加入较高浓度的卡托普利后，ACE的活性受到明显抑制。

2.6 线性关系及检测限 取浓度为1 000.0 μg·mL-1马尿酸对照品，加双蒸水稀释成500.0，100.0，50.0，12.5，5.0 μg·mL-1的对照品溶液。按“2.1”项的色谱条件进行分析。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程为Y=151.5X-2.596 6，r=0.999 9。结果表明马尿酸在0.05～5.00 μg范围内其进样量与峰面积呈良好的线性关系。将马尿酸对照品进行稀释，得出马尿酸的最低检测限为0.2 μg·mL-1(S/N=2)。

2.7 精密度实验 精密吸取50.0 μg·mL-1马尿酸对照品溶液10 μL，按“2.1”项的色谱条件连续进样5次，测定马尿酸峰面积，其RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性实验 取50.0 μg·mL-1的卡托普利溶液按“2.4”项的方法制备供试品溶液，4 ℃保存。在相同色谱条件下，分别于0，3，6，9，24 h进样测定马尿酸峰面积，其RSD为1.04%，结果表明酶反应后供试品溶液于4 ℃保存，24 h内稳定。

A.空白对照组；B.马尿酸对照品；C.实验组；1.马尿酸

图1 ACE活性抑制反应体系的高效液相色谱图

A.blank control group；B.hippuric acid reference；C.test sample；1.hippuric acid

Fig.1 HPLC chromatograms of ACE inhibitory reaction system

2.9 卡托普利对ACE抑制作用的检测 按“2.4”项下方法制备不同浓度卡托普利供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，对不同浓度的卡托普利供试品溶液(0.508×10-3，1.016×10-3，2.031×10-3，4.062×10-3，8.125×10-3，16.250×10-3，32.500×10-3，65.000×10-3μg·mL-1)进样测定峰面积，计算抑制率，其抑制曲线如图2A所示。结果显示随着卡托普利浓度的不

断提高，对ACE的抑制作用呈上升趋势，最大抑制率达98%以上，经SPSS 19.0版统计软件计算其IC50值为2.344×10-3μg·mL-1。不同文献报道卡托普利对ACE的活性抑制率有所不同，其IC50值范围在0.163×10-3～47.802×10-3μg·mL-1[5]。按本实验方法所得到的卡托普利的IC50值也在此范围内，说明本方法具有可行性。

2.10 霉茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素对ACE的抑制作用检测 取5 830.000 μg·mL-1霉茶总黄酮母液加缓冲液制成 2 915.000，1 457.500，728.750，364.375，182.188，58.300，5.830，0.583，0.058，0.006 μg·mL-1的霉茶总黄酮样品溶液。取4 167.000 μg·mL-1二氢杨梅素母液加缓冲液制成2 083.500，1 041.750，520.875，260.437，130.219，41.700，4.170，0.417，0.042，0.004 μg·mL-1二氢杨梅素样品溶液；取420.000 μg·mL-1杨梅素母液加缓冲液稀释制成210.000，105.000，52.500，26.250，13.125，4.200，0.420 μg·mL-1杨梅素样品溶液。再按“2.4”项下方法制成供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定各供试品中马尿酸的峰面积，按照“2.2”项下方法计算抑制率。三者的抑制率曲线见图2B，2C，2D。

从图2中可以看出霉茶总黄酮和二氢杨梅素随浓度的增加对ACE抑制作用亦增强，霉茶总黄酮对ACE的抑制率最高可达94%以上，经统计软件计算其IC50值为42.258 μg·mL-1；二氢杨梅素的抑制率可高达75%以上，其IC50值为30.879 μg·mL-1。说明在高浓度下，霉茶总黄酮和二氢杨梅素对ACE具有较强的抑制作用；从总黄酮的IC50值与二氢杨梅素的IC50值可以推测霉茶总黄酮中主要抑制ACE活性的物质可能为二氢杨梅素。杨梅素对ACE的抑制作用并不随其浓度增加而增强，反而在20～70 μg·mL-1范围内对ACE具有促进其活性的作用。

A.卡托普利；B.总黄酮；C.二氢杨梅素；D.杨梅素

3 讨论

根据本课题组前期实验研究及其他相关文献报道发现霉茶总黄酮具有降压作用[6-8]。在二肾一夹模型上观察到，霉茶总黄酮可使血浆及心肌中血管紧张肽Ⅱ的水平降低[8]。笔者在本实验中利用高效液相色谱法测定ACEI对ACE活性的抑制作用，该方法具有简单快速、灵敏度高、重复性好等优点[9]，可以用于霉茶总黄酮、二氢杨梅素和杨梅素对ACE抑制作用的研究。结果发现霉茶总黄酮和二氢杨梅素对ACE具有较强的抑制作用。通过抑制ACE活性将使无活性的血管紧张肽Ⅰ不能转化为血管紧张肽Ⅱ，使血管紧张肽Ⅱ生成减少，醛甾酮分泌降低，并可阻止缓激肽的降解而使其血管扩张作用增强，刺激前列腺素I2及前列腺素E2的合成，从而使小动脉舒张，周围阻力下降，血压降低[10]。上述结果进一步说明霉茶总黄酮具有降压作用，二氢杨梅素可能为霉茶总黄酮中降压的主要有效成分。

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Determination of Components from Ampelopsis Grossedentata by HPLC and Inhibitory Effect of Its on Angiotensin Converting Enzyme

WU Yong1,2, LUO Hong1, WANG Rui1,2, TAN Yongxia1,2, HU Junjie1,2, ZHANG Baohui1,2, TIAN Xianxiang1,2, ZHENG Guohua1,2, ZHANG Xiaoyi1

(1.SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China； 2.KeyLaboratoryofChineseMedicineResourceandCompositus,MinistryofEducation,Wuhan430065,China)

Objective To measure the inhibition of components fromAmpelopsisgrossedentataon angiotensin converting enzyme (ACE) by high performance liquid chromatograph. Methods By quantitative determination of hippuric acid, the ACE-catalyzed product from the substrate HIPPURYL-HIS-LEU (HHL), the inhibitory effect of the total flavonoids ofAmpelopsisgrossedentata, dihydromyricetin and myricetin were evaluated respectively.High performance liquid chromatograph analysis was conducted on a Welchrom C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), eluting with water : acetonitrile (each containing 0.1% formic acid and 0.1% triethylamine)=78：22, at flow rate of 1.0 mL·min-1under temperature of 30 ℃, and the detection wavelength was set at 228 nm and the injection volume was 10 μL. Results The injection amount of hippuric acid showed good linearity with peak area within the range of 0.05-5.00 μg (r= 0.999 9), and the inhibitory rate of the total flavonoids ofAmpelopsisgrossedentataand dihydromyricetin reached more than 75% against ACE. Conclusion As the method exhibited, the total flavonoids ofAmpelopsisgrossedentataand dihydromyricetin have potent inhibition against ACE.For being simple, sensitive and repeatable, this method can be used for the screening of ACE inhibitorsinvitro.

Components fromAmpelopsisgrossedentata； Angiotensin converting enzyme；Inhibitory effect; Content determination; Chromatograph，high performance liquid

2014-12-11

2015-01-13

*国家自然科学基金资助项目(81173502)

吴勇(1973-)，男，湖北蕲春人，讲师，博士，研究方向：中医药和天然药物药理。电话：027-68890101，E-mail：wuyong1991@163.com。

郑国华(1964-)，男，天津人，博士生导师，博士，研究方向：中药新制剂、新剂型的研究。电话：027-68890113，E-mail：zgh1227@sina.com。

R972.4；R965

A

1004-0781(2015)12-1559-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.003